高温追踪：对来源于Pyrolobus fumarii A1的超嗜热B家族DNA聚合酶的生物信息学与生物化学表征

热稳定性DNA聚合酶是分子生物学中不可或缺的工具，然而，来源于最极端超嗜热生物的酶迄今仍大多缺乏表征。在此，我们报道了来源于Pyrolobus fumarii A1的B家族DNA聚合酶（Pyrfu pol）的生化与结构表征；该古菌是迄今报道的耐热性最强的古菌之一。该酶在E. coli Rosetta 2(DE3)[pLysS]中实现了高效过量表达，并通过结合热处理与固定化金属亲和层析（IMAC）的两步纯化方案纯化至均一。生物信息学分析证实其具有典型的B家族构架，而基于AlphaFold的结构建模及其与中温型RB69 DNA聚合酶的比较分析显示，该酶在保留高度保守的结构核心的同时，也具有热适应性特征。放射性标记掺入实验表明，该酶在较宽的离子强度范围内具有酶活性，并且绝对依赖Mg离子。基于PCR的优化进一步证实了这些结果，并揭示其对pH具有广泛耐受性（6.5–11.0）。值得注意的是，Tris在放射性标记实验（pH 7.0）中表现出抑制作用，却对高效PCR扩增（pH 8.5）至关重要，这提示缓冲液组成对聚合酶活性的影响具有情境依赖性。过程性实验进一步证实，该酶可扩增长度最高约8,000 bp的DNA片段。采用基于lacZ的实验测定复制保真性后发现，其保真性较Taq聚合酶提高了2.9倍。Urea-nanoDSF测得其具有极高的熔解温度，为105.9 ± 0.08 °C。Pyrfu pol还表现出对常见PCR抑制剂的耐受性，凸显了其在分子生物学应用中的潜在价值。

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热追踪：对来自 Pyrolobus fumarii A1 的一类超嗜热 B 家族 DNA 聚合酶的生物信息学与生物化学表征

Wojciech Rusinek， Sebastian Dorawa， Tadeusz Kaczorowski

bioRxiv 2026.06.25.734501； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734501

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热追踪：对来自 Pyrolobus fumarii A1 的一类超嗜热 B 家族 DNA 聚合酶的生物信息学与生物化学表征

Wojciech Rusinek， Sebastian Dorawa， Tadeusz Kaczorowski

bioRxiv 2026.06.25.734501； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734501

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.25.734501v1?rss=1

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