利用针孔照明提高高密度标记神经组织中钙瞬变检测灵敏度——一种低成本方法

对大量神经元进行光学记录是研究神经元群体不可或缺的技术。我们采用通过针孔照明实现的光学切片，以降低在GCaMP6f高密度标记的离体脑切片中的背景荧光（F0），并提高光学信号（{Delta}F/F0），从而使普通荧光显微镜能够捕获超过300个单独CA1神经元的钙瞬变——与普通宽场荧光照明相比，这是显著的提升。多层相互重叠的神经元可以通过其位置以及其{Delta}F/F0图像在空间中的形状加以识别。单个针孔掩模被放置在宽场照明器的视场光阑处，并通过20X、NA 0.95的水浸物镜（Olympus）将针孔的像投射到组织上。这形成了一个直径约为200 m的照明圆盘，以及厚度约为100 m的海马CA1锥体层组织光学切片。该照明方式阻断了大部分F0，从而使{Delta}F/F0相比宽场照明提高了5–10倍。当推定的锥体神经元在脑切片中稀疏放电时，在CA1区域围绕针孔像的厚离体切片（约480 m）中，最多可通过其形状和空间位置识别出300个部分重叠的神经元。即使在相机上每个像素阱中仅约20k光电子的低激发光水平下，信噪比仍然足够，因此可在无显著漂白的情况下实现总计3,000秒的记录时间。这种针孔“半共聚焦”方法为在厚组织中对大群体GCaMP-6f高密度标记神经元的钙瞬变信号进行采样提供了一种有用的方法。

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