nanoASM：长读长等位基因特异性DNA甲基化谱分析助力人类前列腺组织中调控性非编码变异的功能注释

长读长纳米孔测序能够在单个 DNA 分子上同时检测生殖系变异和天然 DNA 碱基修饰，从而为研究等位基因特异性表观遗传调控提供了独特机会。在本研究中，我们对正常和肿瘤前列腺组织进行了全基因组纳米孔测序，以表征与非编码遗传变异相关的差异甲基化、甲基化熵以及等位基因特异性甲基化（ASM）。全基因组分析鉴定出广泛的癌症相关差异甲基化区域（DMR），其中高甲基化 DMR 在转录起始位点附近以及转录调控区域显著富集。与转录组数据集的整合分析显示，启动子甲基化与基因表达之间存在强烈的负相关关系，而 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平在基因体范围内与转录活性呈正相关。 利用长读长测序所支持的片段水平甲基化模式，我们进一步结合 5mCG 和 5hmCG 状态对甲基化熵进行了定量。癌症高甲基化 DMR 表现出显著降低的熵，这与肿瘤进展过程中甲基化状态的克隆性固定相一致。跨染色质注释的熵谱分析表明，部分修饰的增强子相关区域具有最高的表观遗传异质性。为了研究顺式调控的遗传效应，我们开发了一个简洁的 ASM 分析框架（nanoASM），该框架能够按等位基因状态对测序读段进行划分，并直接从长读长数据中鉴定等位基因特异性 DMR。与传统的群体水平甲基化数量性状位点（mQTL）分析相比，ASM 通过利用个体内对比并降低样本层面的异质性，显著提高了统计效率。 尽管生殖系单核苷酸多态性（SNP）在正常和肿瘤组织之间大体共享，但 ASM 模式存在显著差异，其中肿瘤相关 ASM 区域表现出显著更大的基因组跨度和更强的等位基因甲基化差异。与 TCGA 前列腺 mQTL 和 GTEx 前列腺 eQTL 数据集的比较分析表明，ASM 的方向性与下游转录效应之间具有高度一致性，尤其是对于位于 DMR 内部及转录起始位点附近的变异。在 IRX4 前列腺癌风险位点，ASM 鉴定出一个雄激素响应性调控结构域，该结构域与 AR ChIP-seq 和 H3K27ac 峰重叠，并将 rs6885084 确定为候选功能变异。在 PSCA 位点，由 rs4736369 锚定的 ASM 与等位基因特异性甲基化、染色质激活、转录本丰度以及异构体使用相关。总之，这些发现确立了基于纳米孔测序的 ASM 分析作为解析前列腺癌中功能性非编码变异及其所调控调控结构域的强有力方法。

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