一种基于 DIA 的定量交联质谱框架，用于动态结构蛋白质组学

蛋白质会发生动态构象重排和相互作用，而这些过程是其生物学功能的核心。定量交联质谱能够分析这些动态变化和分子相互作用，但针对定量测量的严格置信度评估与经验验证策略仍不完善，同时对包括单链接和蛋白质-RNA 加合物在内的互补结构特征的整合分析也仍然有限。本文提出了一种基于数据非依赖性采集（DIA）的定量交联质谱框架（DIA-QCLMS），该框架结合了优化的采集策略、交联感知的谱库以及经验性假发现率（FDR）验证。该工作流程支持交联物、单链接和蛋白质-RNA 加合物，并整合了来自两种交联搜索引擎（xiSEARCH 和 MSAnnika）的谱库生成。为实现对 DIA 数据中置信度的稳健评估，我们开发了四状态靶标-诱饵谱库策略，显式建模了靶标-靶标、靶标-诱饵、诱饵-靶标和诱饵-诱饵交联谱。实验性诱捕数据集使置信度估计的经验验证成为可能，而以 PhoX 交联 Cas9 为基准的测试表明，与数据依赖性采集相比，该方法在定量完整性和可重复性方面均有所提升。将该工作流程应用于 ATP 依赖性 RNA 解旋酶 UAP56（DDX39B）时，解析出了与其从开放构象向钳夹构象转变相关的配体依赖性分子内约束变化、残基可及性变化以及候选 RNA 接触位点。这些结果确立了 DIA-QCLMS 作为一种可扩展的定量结构蛋白质组学框架，并为在置信度可控条件下分析动态蛋白质相互作用和构象状态提供了实用策略。

蛋白质会发生动态构象重排和相互作用，而这些过程是其生物学功能的核心。定量交联质谱能够分析这些动态过程和分子相互作用，但针对定量测量的严格置信度评估与经验性验证策略仍不完善，对包括单链接和蛋白质-RNA加合物在内的互补结构特征进行整合分析的能力也仍然有限。在此，我们提出了一种基于数据非依赖采集（DIA）的定量交联质谱框架（DIA-QCLMS），该框架结合了优化的采集策略、交联感知型谱库以及经验性假发现率（FDR）验证。该工作流程支持交联、单链接和蛋白质-RNA加合物，并整合了来自两种交联搜索引擎（xiSEARCH 和 MSAnnika）的谱库生成。为了在DIA数据中实现稳健的置信度评估，我们开发了一种四状态靶标-诱饵谱库策略，能够显式建模靶标-靶标、靶标-诱饵、诱饵-靶标和诱饵-诱饵交联谱图。实验性诱捕数据集使得置信度估计的经验性验证成为可能，而基于PhoX交联Cas9的基准测试表明，与数据依赖采集相比，该方法在定量完整性和重复性方面均有所提升。将该工作流程应用于ATP依赖性RNA解旋酶UAP56（DDX39B）后，解析出了与其从开放构象向钳夹构象转变相关的、配体依赖性的分子内约束、残基可及性以及候选RNA接触位点变化。这些结果确立了DIA-QCLMS作为一种可扩展的定量结构蛋白质组学框架的地位，并为在受控置信度条件下分析动态蛋白质相互作用和构象状态提供了切实可行的策略。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.16.732730v1?rss=1

🏷️ 定量交联质谱 数据非依赖性采集 结构蛋白质组学 蛋白质构象动态 假发现率评估