长读长基因组测序揭示了深度表征的克隆性 CD19 CAR-T 载体拷贝数参考细胞系中慢病毒前病毒插入的复杂变异性

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种涉及前病毒插入基因组的重要治疗方法。对这些插入进行表征对于理解细胞产品的安全性和有效性至关重要，但这些插入的序列尚未得到充分表征。我们构建了克隆性CD19 CAR-T细胞系，其中含有1至5份慢病毒前病毒插入拷贝。载体拷贝数（VCN）通过液滴数字PCR（ddPCR）测定，结果显示大多数元件（LTR、Psi、RRE、CD19和WPRE）在每个细胞中为1至5或6拷贝。DdPCR数据还显示，在VCN4和VCN5细胞系中，eGFP基因额外多出1份拷贝。为了全面表征这些插入的序列和位置，我们采用了短读长和长读长全基因组测序，以及数字PCR和流式细胞术。长读长测序能够对每一个插入实现完全解析，我们发现，在10个插入事件中，3个具有预期的插入序列，2个仅在小变异方面与预期不同，3个存在结构异常，另有2个为被大多数其他方法遗漏的小型部分插入。一个尤为重要且仅能通过长读长测序解析的结构异常是EF1启动子发生了724 bp缺失，从而破坏了CD19 CAR的表达。标准短读长测序和ddPCR方法由于该常用启动子存在于未经工程改造的人类基因组中，因此未能检测到这一缺失。这些结果表明，这些细胞系适合作为1至5或6拷贝VCN的参考标准，并突出了长读长测序在表征慢病毒工程化细胞中插入数量和质量两方面的实用价值。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种涉及前病毒插入基因组的重要治疗方法。对这些插入事件进行表征对于理解细胞产品的安全性和有效性至关重要，但这些插入的序列尚未得到充分表征。我们构建了克隆性CD19 CAR-T细胞系，其中含有1至5份慢病毒前病毒插入拷贝。载体拷贝数（VCN）通过液滴数字PCR（ddPCR）测定，结果显示大多数元件（LTR、Psi、RRE、CD19和WPRE）在每个细胞中为1至5或6份拷贝。DdPCR数据还显示，在VCN4和VCN5细胞系中，eGFP基因存在额外的一份拷贝。为全面表征这些插入的序列和位置，我们采用了短读长和长读长全基因组测序，以及数字PCR和流式细胞术。长读长测序能够对每个插入事件进行完整解析，我们发现，在10个插入事件中，3个具有预期的插入序列，2个仅在小变异方面与预期序列不同，3个存在结构异常，另有2个为大多数其他方法未能检测到的小型部分插入。一个尤为重要且仅通过长读长测序解析出的结构异常，是EF1启动子发生了724 bp缺失，从而破坏了CD19 CAR的表达。由于这一常用启动子存在于未经工程改造的人类基因组中，标准短读长测序和ddPCR方法未能检测到该缺失。这些结果表明，这些细胞系可作为1至5或6份拷贝VCN的合适参考标准，并凸显了长读长测序在表征慢病毒工程化细胞中插入事件的数量和质量方面的实用价值。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.15.731627v1?rss=1

🏷️ 长读长测序 CAR-T细胞 慢病毒前病毒插入 载体拷贝数 基因组结构变异