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背景：表观遗传时钟是基于 DNA 甲基化的生物标志物，正日益广泛用于衰老研究和临床试验。近期一项针对 18 种时钟在多种短期扰动条件下的评估得出结论，认为大多数时钟仅表现出中等程度的生物学可靠性，从而引发了对其转化应用价值的担忧。然而，要理解生物学变异性，首先需要理解每种时钟的构建方式：不同的时钟捕捉的是彼此不同的生物学属性，这些属性对特定扰动的响应也不同；此外，将异质人群和不同芯片平台中的可靠性指标合并分析，可能会掩盖驱动各类变异性的具体机制。 方法：我们评估了 24 种表观遗传时钟，涵盖五类构建类别——第一代和第二代经典时钟（如 Horvath、Hannum、PhenoAge）、经典时钟的 PC 版本、SystemsAge 器官系统时钟、基于死亡风险训练的时钟（GrimAge、PCGrimAge、OMICmAge）、衰老速度时钟（DunedinPACE）以及 IntrinClock。分析基于三个数据集开展：个体内配对禁食设计（n = 15 对）、禁食与非禁食横断面队列（n = 2,895），以及 EPICv2custom 技术重复样本（来自 4 名个体的 96 个样本）。针对每种时钟，我们在有无免疫细胞校正的条件下量化急性禁食效应，在逐级校正水平（Raw、EAA、IAA）下分解个体间与个体内方差，并将生物学变异性与技术测量下限进行基准比较。 结果：禁食后急性再进食与免疫敏感型时钟在群体水平上出现 0.5–3 年的偏移相关，而个体内可靠性仍然保持较高水平（Raw 时钟 ICC 中位数约为 0.96）。这两种观察结果是相容的，因为与主导 ICC 分母的、由年龄驱动的个体间方差相比，禁食效应相对较小。所观察到的偏移幅度因时钟而异。在配对队列中，PC 转换版本较其经典对应版本表现出更大的效应（PC Hannum -2.03 年，对比 Hannum -1.37 年；PC PhenoAge > PhenoAge；PC Horvath > Horvath）；SystemsAge 显示出最大的效应（禁食时年轻 1.15–2.9 年）；而基于死亡风险训练的时钟（GrimAge V1/V2、OMICmAge）及 DunedinPACE 未检测到急性效应（所有 FDR 校正后 p > 0.10）。在敏感型时钟中，免疫细胞校正削弱或消除了禁食效应（PC Hannum 衰减 88%；SystemsAge Blood 衰减 99.7%）；在任一队列中，经 FDR 校正后的免疫校正后均无时钟保留显著的禁食效应。在横断面队列中，时钟的“免疫含量”——即其年龄独立方差中可由免疫细胞组成解释的比例——与免疫校正削弱其禁食效应的程度相关（r = 0.68，p = 0.003）。IntrinClock 在设计上排除了免疫可变 CpG，因而在两个队列中均未显示禁食效应（immune R-squared = 3.2%），可作为阴性对照。技术重复样本证实测量重复性近乎完美（Raw ICC 中位数 > 0.97），表明禁食配对样本中的方差反映的是生物学差异而非噪声。免疫校正后的 ICC 在不同时钟间呈现出不同变化方式，且与其构成一致：对于禁食引起个体内方差的时钟，免疫校正消除了该方差，ICC 随之升高（SystemsAge EAA 0.768 升至 IAA 0.913）；对于不受禁食影响的时钟，免疫校正消除了个体间结构，ICC 则显著下降（OMICmAge 0.922 降至 0.160），这反映了将大量免疫细胞预测变量拟合到稳定残差上所带来的估计代价。横断面重复分析（n = 2,895）进一步在大样本尺度上证实了免疫细胞重分布现象。尽管对急性禁食具有抵抗性，死亡风险时钟在横断面分析中仍达到统计学显著性。 结论：隔夜禁食后的急性再进食会引起部分表观遗传时钟的小幅偏移，并且在我们的数据中，这种偏移按训练类别呈现系统性差异。基于 PC 的时钟由于集中捕捉了相关 CpG 方差，包括与免疫细胞组成相关的方差，因此表现出最大的偏移；而基于死亡风险训练的时钟则未显示可检测的急性效应。若仅基于可靠性框架报告 ICC，而不同时检验系统性的群体水平效应，就可能遗漏本研究在禁食条件下观察到的这类结构化生物学变异。ICC 并非时钟的固定属性，而是受到研究设计、人群异质性、扰动类型以及所施加校正方式的共同影响。我们建议在特定扰动背景下、针对每一种时钟分别评估其可靠性，并在每一校正层级上进行方差分解，同时与技术重复样本进行明确的基准比较。
背景：表观遗传时钟是基于 DNA 甲基化的生物标志物，正日益广泛地应用于衰老研究和临床试验。近期一项针对 18 种时钟在多种短期扰动条件下的评估认为，大多数时钟仅表现出中等程度的生物学可靠性，这引发了人们对其转化应用价值的担忧。然而，要理解生物学变异性，必须先理解每一种时钟的构建方式：不同的时钟捕捉不同的生物学属性，而这些属性对特定扰动的反应也不同；此外，将来自异质性人群和不同芯片平台的可靠性指标进行汇总，可能会掩盖驱动各类变异性的具体机制。
方法：我们评估了 24 种表观遗传时钟，涵盖五类构建类别——第一代和第二代经典时钟（如 Horvath、Hannum、PhenoAge）、经典时钟的 PC 版本、SystemsAge 器官系统时钟、以死亡率为训练目标的时钟（GrimAge、PCGrimAge、OMICmAge）、衰老速度时钟（DunedinPACE）以及 IntrinClock，使用了三个数据集：个体内配对禁食设计（n = 15 对）、禁食与非禁食横断面队列（n = 2,895），以及 EPICv2custom 技术重复数据（来自 4 名个体的 96 份样本）。对于每一种时钟，我们在校正和未校正免疫细胞的条件下量化了急性禁食效应，在连续调整水平（Raw、EAA、IAA）下分解了个体间与个体内方差，并将生物学变异性与技术测量下限进行了基准比较。
结果：禁食后急性再进食与免疫敏感型时钟在群体水平上发生 0.5–3 岁的偏移相关，而个体内可靠性仍然保持较高水平（Raw 时钟 ICC 中位数约为 0.96）。这种现象彼此并不矛盾，因为与主导 ICC 分母的年龄驱动个体间方差相比，禁食效应相对较小。观察到的偏移幅度因时钟而异。在配对队列中，PC 转换版本较其经典对应版本显示出更大的效应（PC Hannum -2.03 对 Hannum -1.37 岁；PC PhenoAge > PhenoAge；PC Horvath > Horvath）；SystemsAge 显示出最大的效应（禁食时年轻 1.15–2.9 岁）；而以死亡率为训练目标的时钟（GrimAge V1/V2、OMICmAge）以及 DunedinPACE 未显示出可检测的急性效应（所有 FDR 校正后 p > 0.10）。免疫细胞校正减弱或消除了敏感时钟中的禁食效应（PC Hannum 衰减 88%；SystemsAge Blood 衰减 99.7%）；在任一队列中，经 FDR 校正后的免疫调整后，没有任何时钟仍保留显著的禁食效应。在横断面队列中，时钟的免疫成分——即其年龄独立方差中可由免疫细胞组成解释的比例——与免疫调整对其禁食效应的衰减程度相关（r = 0.68，p = 0.003）。IntrinClock 旨在排除免疫可变 CpG 位点，在两个队列中均未显示禁食效应（免疫 R 平方 = 3.2%），因而可作为阴性对照。技术重复结果证实了近乎完美的测量可重复性（Raw ICC 中位数 > 0.97），表明禁食配对样本中的方差反映的是生物学差异，而非噪声。免疫调整后的 ICC 在不同时钟间表现出不同变化方式，且与其组成特征一致：对于禁食产生个体内方差的时钟，免疫调整移除了该方差，ICC 随之升高（SystemsAge EAA 0.768 升至 IAA 0.913）；对于不受禁食影响的时钟，免疫调整则移除了个体间结构，ICC 显著下降（OMICmAge 0.922 降至 0.160），这反映了在稳定残差上拟合多个免疫细胞预测变量所带来的估计代价。横断面重复验证（n = 2,895）在大样本尺度上证实了免疫细胞再分布。尽管对急性禁食具有耐受性，死亡率时钟在横断面分析中仍达到了统计学显著性。
结论：过夜禁食后的急性再进食会在部分表观遗传时钟中引发小幅偏移，而且在我们的数据中，这种偏移按训练类别呈现系统性差异。基于 PC 的时钟由于集中捕捉了相关 CpG 方差，包括与免疫细胞组成相关的方差，因此表现出最大的偏移；以死亡率为训练目标的时钟则未显示出可检测的急性效应。仅依赖可靠性、仅报告 ICC 而不同时检验系统性群体水平效应的框架，可能会遗漏本研究在禁食条件下观察到的这类结构化生物学变异。ICC 并不是时钟的固定属性，而是受到研究设计、人群异质性、扰动类型以及所施加调整的共同影响。我们建议，应当针对特定扰动、逐一针对每种时钟评估其可靠性，在每一调整水平下进行方差分解，并与技术重复结果进行明确的基准比较。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.04.729731v1?rss=1
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