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无病毒基因组工程为构建基因修饰细胞模型提供了相较于病毒载体更为灵活的替代方案。在此，我们建立了一套与生物安全一级（BSL-1）兼容的整合式 CRISPR/Cas9 同源定向修复（HDR）流程，采用非病毒递送方法在神经母细胞瘤细胞系中实现稳定的转基因敲入。 我们系统评估了供体盒架构及递送条件，涵盖基于电穿孔的 Cas9 核糖核蛋白复合物（RNP）递送，以及脂质纳米颗粒（LNP）介导的 Cas9 mRNA、sgRNA 和供体 DNA 共递送。以 AAVS1 位点为靶标的模块化供体构建体鉴定出一种紧凑型 EF1(s)-Donor-Q8-Tag-sPA 盒，该构型在 HDR 相关的敲入读出中持续表现出最强信号，在无需 HDR 增强剂的电穿孔条件下，稳定报告基因阳性细胞比例最高可达 60%。尽管 LNP 介导的递送可实现 CRISPR 载荷的高效共递送并生成基因修饰的肿瘤细胞群体，其敲入效率仍低于电穿孔所观察到的水平。后续富集策略使得两种递送方式均能够获得高纯度的编辑细胞群体。 功能验证表明，转基因在体外可实现稳定表达，包括在三维生物打印肿瘤模型中；并且在异种移植小鼠体内同样保持稳定表达，且不影响肿瘤生长或细胞活性。综上，这些结果建立了一个用于稳定改造实体瘤模型的实用型无病毒 HDR 平台，并为不同递送模式下基因组编辑流程的进一步优化提供了框架。
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摘要
无病毒基因组工程为构建基因修饰细胞模型提供了相较于病毒载体更灵活的替代方案。在持有人为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。 保留所有权利。未经许可不得再利用。
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发表于 2026 年 6 月 4 日。
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用于稳定工程化实体瘤模型的非病毒 CRISPR/Cas9 HDR 平台。
Shoaib Afzal， Maximilian Pilgram， Julia Macos， Emily Ohlendorf， Lena Olivia Raab， Jonas Kath， Viktor Glaser， Ana-Maria Nitulescu， Casper F T van der Ven， Chahrazad Lachiheb， Maria Stecklum， Norman M Drzeniek， Kathleen Anders， Dimitrios Laurin Wagner， Ralf Kuehn， Annette Kuenkele， Michael Launspach
bioRxiv 2026.06.01.729035； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.01.729035
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用于稳定工程化实体瘤模型的非病毒 CRISPR/Cas9 HDR 平台。
Shoaib Afzal， Maximilian Pilgram， Julia Macos， Emily Ohlendorf， Lena Olivia Raab， Jonas Kath， Viktor Glaser， Ana-Maria Nitulescu， Casper F T van der Ven， Chahrazad Lachiheb， Maria Stecklum， Norman M Drzeniek， Kathleen Anders， Dimitrios Laurin Wagner， Ralf Kuehn， Annette Kuenkele， Michael Launspach
bioRxiv 2026.06.01.729035； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.01.729035
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.01.729035v1?rss=1
🏷️ CRISPR/Cas9 同源定向修复 非病毒递送 肿瘤模型 基因敲入 神经母细胞瘤