- 1次围观
人类尿黑酸1,2-双加氧酶（HGD）催化尿黑酸（HGA）氧化裂解生成马来乙酰乙酸（MAA），这是酪氨酸降解过程中的关键步骤。HGD活性的丧失会导致尿黑酸尿症（AKU），这是一种以有毒HGA积累为特征的罕见遗传性代谢疾病。目前采用尼替西农的治疗可降低HGA水平，但无法恢复HGD功能，因此有必要进一步研究HGD的结构–功能关系。 在本研究中，我们应用知识获取导向进化（Knowledge Gaining Directed Evolution，KnowVolution）策略，探究氨基酸取代如何影响人类HGD的催化活性和结构完整性。催化活性在大肠杆菌中进行评估，采用定量检测MAA随时间生成量的分析方法。在KnowVolution的四个阶段中，鉴定出多种在保持酶功能的同时调节催化活性的取代。值得注意的是，这些具有影响的取代均不位于催化口袋内；相反，它们主要发生在表面暴露位点或结构性位点。 结构映射、界面分析和计算稳定性预测表明，某些取代有助于六聚体稳定，而另一些则可能通过涉及口袋重塑的间接、非催化机制改变活性。组合取代表现出非加和效应，既可能是协同的，也可能是拮抗的，这表明其影响无法由各单一取代的贡献进行预测。通道和口袋分析显示，N31S、S54D和D86H产生了更紧凑的六聚体，而Q354P+P359E双突变体降低了催化口袋的溶剂可及性和体积，从而支持了所观察到的活性差异。 总体而言，这些发现表明，HGD活性可被催化口袋外的取代所调节，为理解HGD功能以及AKU潜在的基因型–表型关系提供了新的见解。
人源尿黑酸1,2-双加氧酶（HGD）催化尿黑酸（HGA）氧化裂解生成马来酰乙酰乙酸（MAA），这是酪氨酸降解过程中的关键步骤。HGD活性的缺失会导致尿黑酸尿症（AKU），这是一种以有毒HGA积累为特征的罕见遗传性代谢紊乱。当前采用尼替西农的治疗可降低HGA水平，但无法恢复HGD功能，因此有必要进一步研究HGD的结构–功能关系。
在本研究中，我们采用知识获取导向进化（Knowledge Gaining Directed Evolution，KnowVolution）策略，考察氨基酸取代如何影响人源HGD的催化活性和结构完整性。催化活性通过在大肠杆菌中进行的测定来评估，该测定对MAA随时间的生成进行定量分析。在KnowVolution的四个阶段中，鉴定出多个在保持酶功能的同时调节催化活性的取代。值得注意的是，这些具有显著影响的取代无一位于催化口袋内；相反，它们主要出现在表面暴露位点或结构性位点。结构映射、界面分析和计算稳定性预测表明，部分取代有助于六聚体稳定化，而另一些则可能通过涉及口袋重塑的间接、非催化机制改变活性。组合取代表现出非加和效应，既可能呈现协同作用，也可能呈现拮抗作用，这表明其影响无法由各单独贡献进行预测。通道和口袋分析显示，N31S、S54D和D86H形成了更为紧凑的六聚体，而Q354P+P359E双突变体降低了催化口袋的溶剂可及性和体积，这支持了所观察到的活性差异。
总体而言，这些发现表明，HGD活性可通过催化口袋之外的取代进行调节，从而为理解HGD功能以及AKU潜在的基因型–表型关系提供了新的见解。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.02.729205v1?rss=1
🏷️ 尿黑酸尿症 尿黑酸1,2-双加氧酶 定向进化 酶结构功能关系 六聚体稳定性 基因型-表型关系