融合非特异性DNA结合结构域可增强Cas12a的反式切割活性，用于稳健的核酸诊断

CRISPR-Cas12a 是强大的基因组编辑和核酸检测技术的基础，但其性能受限于靶标结合效率低以及催化周转率不足，尤其是在靶标丰度较低和温度升高的条件下。在此，我们报道了一种模块化蛋白质工程策略：将超嗜热 DNA 结合蛋白 Sso7d 融合至 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a（LbaCas12a）的 N 端，以增强 Cas12a 的反式活性。所得融合酶与野生型 Cas12a 相比，检测灵敏度提高了 2 倍，kcat 提高了 4.6 倍，且反式切割动力学显著加快。这些性能提升在多种引导 RNA、不同 DNA 底物以及 37 至 60°C 的宽温度范围内均可观察到。 工程化 Cas12a 能够对来自多株鲍曼不动杆菌、且其耐药谱已通过独立方法验证的内源性 blaOXA-51 和获得性 blaOXA-24 抗生素耐药基因实现稳健检测，而野生型 Cas12a 几乎不产生或完全不产生可检测信号。信号输出最高可提高 30 倍，从而扩展了有效检测窗口并缩短了获得阳性结果所需时间。综上，这些结果表明，融合辅助性 DNA 结合结构域可作为将 Sso7d 融合至 LbCas12a 的概念验证，同时这一策略推广至其他 CRISPR 效应蛋白或非特异性 DNA 结合结构域，也为未来研究提供了一条令人振奋的途径。

CRISPR-Cas12a 是强大的基因组编辑和核酸检测技术的基础，但其性能受限于靶标结合效率低和催化周转率低，尤其是在靶标丰度较低和温度升高的条件下。本文报道了一种模块化蛋白质工程策略，通过将超嗜热 DNA 结合蛋白 Sso7d 融合至 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a（LbaCas12a）的 N 端，以增强 Cas12a 的反式活性。所得融合酶与野生型 Cas12a 相比，检测灵敏度提高了 2 倍，kcat 增加了 4.6 倍，且反式切割动力学显著加快。这些增强效应在多种引导 RNA、不同 DNA 底物以及 37 至 60°C 的宽温度范围内均可观察到。

经工程化改造的 Cas12a 能够稳健检测来自多株鲍曼不动杆菌、且其耐药谱已通过独立方法验证的内源性 blaOXA-51 和获得性 blaOXA-24 抗生素耐药基因，而野生型 Cas12a 几乎不产生或完全不产生可检测信号。信号输出最高可提高 30 倍，从而扩大了有效检测窗口并缩短了阳性检出时间。综上，这些结果确立了融合辅助 DNA 结合结构域作为将 Sso7d 融合至 LbCas12a 的概念验证，同时表明，将该策略推广至其他 CRISPR 效应蛋白或非特异性 DNA 结合结构域，是未来研究中一条令人振奋的探索方向。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.30.729025v1?rss=1

🏷️ CRISPR-Cas12a 蛋白质工程 核酸诊断 反式切割活性 抗生素耐药基因