- 1次围观
人类胚胎在植入子宫后会经历形态发生转变，然而，由于无法观察胚胎，这一关键阶段的认知仍然有限。
人类生殖的效率显著偏低，据估计，约有60%的妊娠在受精后的前两周内失败。
近期在小鼠胚胎中的研究建立了适用于人类胚胎的条件。
已开发出多种方案，可从人胚胎干细胞（hESCs）中诱导获得滋养层细胞和下胚层细胞。
我们表明，由诱导的胚外样谱系与野生型hESC聚集形成的细胞团块，能够自组织为类胚胎结构，模拟植入后发育的若干关键特征，包括腔形成、羊膜形成、原始生殖细胞形成以及前部下胚层的特化。重要的是，这些可诱导的人类类胚体具有模块化特征，不依赖外源性信号因子，并且便于进行遗传扰动。
通过表达Gata4或Cdx2，小鼠胚胎干细胞（ESCs）可分别被诱导生成胚外内胚层或滋养层，这些细胞能够在三维类胚体模型中模拟发育过程。
（A）诱导型GATA6（iG6）和/或SOX17（iS17）人胚胎干细胞（hESCs）的构建，以及在基础N2B27培养基中加入强力霉素24小时后的验证。N=3次独立实验，包括551个iG6细胞、550个iS17细胞和707个G6-S17细胞。 （B）诱导型GATA3（iG3）和/或AP2γ（iAP2γ）人胚胎干细胞（hESCs）的构建，以及在基础N2B27培养基中加入强力霉素24小时后的验证。N=3次独立实验，包括1456个iG3细胞、409个iAP2γ细胞和782个iG3-AP2γ细胞。 （C）对经3天强力霉素诱导后的测序野生型（RSeT WT）、诱导型GATA6-SOX17（第3天 iG6-S17）和诱导型GATA3-AP2γ（第3天 iG3-AP2γ）RSeT hESCs进行基于统一流形近似与投影（UMAP）的降维可视化。 （D）Logistic回归分析及细胞与人类植入后胚胎细胞群的比较。细胞系数据投射到Molè等人（2021）的人类胚胎数据上。 （E）经3天强力霉素诱导后的野生型、诱导型GATA6-SOX17和诱导型GATA3-AP2γ RSeT hESCs的RNA测序筛选差异表达基因（蓝色；左）以及由ATAC测序预测并通过chromVAR评分的差异基序可及性（粉色；右）。 （F）野生型、诱导型GATA6-SOX17和诱导型GATA3-AP2γ RSeT hESCs在二维共培养条件下的验证。
为了评估所筛选候选转录因子将 hESCs 程序化为类胚外细胞身份的能力，我们在处于从 naïve 到 primed 多能性谱系不同状态的细胞中，分别单独或联合过表达这些转录因子。我们采用了三种已建立的起始培养条件：PXGL，用于支持植入前样 naïve hESCs；RSeT，用于产生处于中间围植入期样多能状态的 hESCs；以及常规 mTeSR1 条件，用于维持植入后样 primed hESCs。在基础 N2B27 培养基中进行三天转录因子过表达后，我们观察到，无论使用单个还是联合转基因，且无论起始于何种多能状态，在蛋白质和 mRNA 水平均出现了胚外基因诱导的显著差异（
在驱动类滋养层细胞形成时，AP2γ 转基因在上调 GATA2 和 CK7 表达方面似乎尤其有效。然而，单独诱导 AP2γ 会导致 primed 细胞发生死亡并丧失转基因表达，而在 RSeT 或 PXGL 细胞中则未出现这种情况（
我们推测，RSeT hESCs 是生成我们干细胞来源的人植入后胚胎模型的最佳起始细胞类型，因为它们：（1）代表发育的围植入期阶段
为了进一步表征诱导表达 GATA6-SOX17 或 GATA3-AP2γ 的 RSeT hESCs，我们进行了单细胞 10x multiome 测序，并同时评估了转录组和染色质可及性。当使用统一流形近似与投影（UMAP）对这些单细胞数据进行可视化时，细胞根据细胞类型发生聚类（
由于这三种来源于 RSeT hESC 的细胞类型——野生型、GATA6-SOX17 诱导型和 GATA3-AP2γ 诱导型——均可在 N2B27 培养基中共培养，我们首先用强力霉素诱导所选转录因子的表达 3 天，以生成类下胚层和类滋养层细胞，随后在 Aggrewell 培养皿中对细胞混合物进行聚集（
(A) 通过将野生型 RSeT hESC 与可诱导的胚外样细胞结合，生成人可诱导胚样体的实验方案概述。为生成下胚层样细胞，使用了可诱导 GATA6-SOX17（iG6-S17）。为生成滋养层样细胞，使用了可诱导 GATA3-AP2γ（iG3-AP2γ）。胚外样细胞在第 0 天聚集前诱导 3 天。 (B) 聚集后第 1 天至第 3 天细胞聚集体的大小。N=5 次独立实验，其中第 1 天结构 175 个、第 2 天结构 171 个、第 3 天结构 91 个。 (C) 聚集后 96 小时，结构表现出清晰的自组织，其内部为 SOX2 阳性区域，周围依次被 GATA6 阳性和 GATA3 阳性胚外样细胞群层包围。 (D) 可诱导人胚样体在内部 SOX2 阳性区域内表现出明确的顶-底极性，包括 PODXL 阳性腔形成，以及 SOX2 阳性上胚层样区室与下胚层样区室之间基底侧 laminin 的沉积。 (E) 可诱导人胚样体形成效率及其组织化程度的定量。N=5 次独立实验，共 952 个用于三谱系分析的结构；N=3 次独立实验，共 506 个用于腔形成和 ECM 效率分析的结构。 (F) 不同起始多能性状态下可诱导人胚样体形成的定量。N=5 次独立实验，共定量分析 1189 个结构。 (G) 下胚层样区域表达 N-Cadherin 和 SOX17。来源于可诱导 GATA3-AP2γ 的细胞（表达 GFP）显示出明确的外侧定位。 (H) 体外培养的人胚胎在受精后第 9 天的代表性图像，显示出清晰的腔化 SOX2 区域，周围包绕一层 GATA6 阳性细胞。其中一部分 GATA6 阳性细胞表达前部下胚层标志物 CER1。比例尺 = 100 mm。统计学方法：（F）采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合 Dunnett 多重比较检验。*p
我们以 1:1:2 的比例铺板野生型:GATA6-SOX17-可诱导:GATA3-AP2γ-可诱导细胞，细胞数为 3.6 × 10
我们的可诱导人胚样体还以有序方式表达了其他若干谱系标志物，包括推定下胚层样区室中的 N-Cadherin 和 SOX17，以及推定滋养层样细胞外层中的 CDX2（
为深入了解我们的人胚模型是否形成了与天然人胚胎一致的基因表达和染色质可及性模式，我们对聚集后第 4、6 和 8 天的人胚模型进行了单细胞多组学 RNA 和 ATAC 测序。
（A）诱导型人类胚样体的延长培养方案示意图，以及使用 10x 平台进行单细胞 RNA 测序和单细胞 ATAC 测序联合采样的流程。（B）基于利用 scmap 结合 RNA 速度与染色质速度，对多个人人类及非人灵长类胚胎数据集进行转录投射，对细胞进行了注释。（C）各细胞簇中 RNA 测序数据中筛选出的差异表达基因（上，蓝色）以及在 ATAC 测序数据中由 chromVAR 评分预测的差异可及基序（下，粉色）。（D）诱导型人类胚样体在第 6 天下调 SOX2，并上调 CDX2、ISL1，在第 8 天上调 VTCN1，提示发生了稳健的羊膜分化与成熟。（E）原始生殖细胞标志基因的模块评分（Jo 等，2021）。（F）各细胞簇中所选原始生殖细胞基因的热图。（G）通过免疫荧光鉴定诱导型人类胚样体中 SOX17/NANOG/AP2γ 三阳性的类原始生殖细胞，箭头所示。（H）第 4 天（n=10 个胚样体）和第 6 天（n=10 个胚样体）SOX17/NANOG/AP2γ 三阳性（+）细胞的定量。N=2 次独立实验。比例尺 = 100 µm。
近期研究提出，羊膜和原始生殖细胞（即配子的前体）至少部分来源于一种双能祖细胞。
一般认为，在灵长类胚胎中，羊膜和胚外间充质的产生是对 BMP 信号响应的结果。
为进一步理解我们的人类胚胎模型中潜在的组织间串扰，我们使用了计算工具 CellPhoneDB。
为验证 BMP 信号在该胚胎模型内部区域分化过程中是否发挥活性作用，我们检测了磷酸化（p）SMAD1.5 的表达。聚集后第 4 天和第 6 天，在 OCT4 阳性的类上胚层区域中观察到 pSMAD1.5 富集，提示 BMP 信号处于活跃状态（
BMP 信号通过前部下胚层的拮抗作用被限制于胚胎后部；前部下胚层分泌 BMP、WNT 和 NODAL 的抑制因子，包括 CER1 和 LEFTY1。
综合来看，这些数据凸显了下胚层细胞亚群分化所依赖的基因调控网络在功能上的差异：持续且高水平的 SOX17 表达会拮抗前部下胚层身份，转而促进 CER1 阴性的下胚层身份。因此，通过调控诱导型人类胚样体中的类下胚层细胞，我们揭示了类上胚层区域上调原条标志物的能力，表明这一模块化胚胎模型在研究胚内与胚外组织相互作用方面具有重要价值。
在此，我们构建了一种由多谱系干细胞衍生的人类着床后胚胎模型，该模型在其类上胚层结构域中经历腔形成，并发生反映类胚外组织与类胚胎组织之间相互作用的分化事件。我们的人类胚胎模型在BMP信号作用下形成类羊膜细胞，这些细胞沿着灵长类之间保守的发育轨迹逐步成熟，从AP2α阳性转变为ISL1和CDX2阳性，最终成为VTCN1阳性的羊膜细胞。
我们表明，调节用于驱动类下胚层细胞诱导的转录因子组合，会使下胚层贡献的平衡从CER1阴性的类下胚层细胞（GATA6-SOX17诱导）转向CER1阳性的前部类下胚层细胞（仅GATA6诱导）。聚集后第4天前部类下胚层样细胞的存在似乎能够在更长时间内保护类上胚层结构域的多能性，从而使其在发育上更晚的阶段退出多能状态。该结果与聚集后第6天原条标志物BRY/TBXT表达升高的现象一致。这些结果表明，RSeT hESCs随时间推移在该胚胎模型中获得了分化为类原条细胞的能力，这与其他naïve hESC的报道一致。
在本研究中，我们通过驱动特定转录因子的表达，由多能性hESCs生成了两种胚外细胞类型，并将其与亲本hESC细胞系结合，构建了一个着床后人类胚胎模型。通过转录因子介导诱导胚外细胞的方法，也已被用于构建着床后干细胞衍生的小鼠胚胎模型。
总之，我们提出了一个模块化、易于操控的人类着床后发育模型，关键在于其同时包含类胚胎细胞和类胚外细胞。这是一个着床后模型，因此不具备发育形成可存活人类胚胎的能力，因为其不能植入。这些可诱导的人类胚样体并不模拟原条形成之后的发育阶段，也不包含原肠胚阶段胚胎的全部细胞类型。
人胚胎干细胞（Shef6）的相关研究在英国人类干细胞库指导委员会批准下开展，批准编号为 SCSC21-38，并遵循《英国人类干细胞系使用实践规范》的相关规定。人类胚胎研究受人类受精与胚胎学管理局（HFEA）监管，并在许可证 R0193 下开展。伦理批准由剑桥大学人类生物学研究伦理委员会获得（参考编号 HBREC.2021.26）。CARE Fertility、Bourn Hall Fertility 和 Herts & Essex Fertility Clinics 的 IVF 患者在治疗结束时获得了针对本项目的相关信息。所有患者均获提供咨询服务，未获得任何经济利益，并可在胚胎用于研究之前的任何时间撤回参与。胚胎培养未超过受精后 14 天，亦未超过原条首次出现的时间点。
Shef6 人胚胎干细胞在 Matrigel 包被培养板上于 mTESR 培养基（05825，STEMCELL Technologies）中培养，培养条件为 37°C、20% O2、5% CO2。培养板以溶解于 DMEM/F12（21331-020，Life Technologies）中的 1.6% 低生长因子 Matrigel（356230，BD Biosciences）于 37°C 包被 1 小时。hESCs 采用 TrypLE（12604013，ThermoFisher Scientific）进行传代。传代后最初 24 小时内加入 10 µM ROCK 抑制剂 Y-27632（72304，STEMCELL Technologies）。培养基每 24 小时更换一次。细胞常规采用 PCR（6601，Takara Bio）检测支原体污染。为将 primed 状态 hESCs 转换为 RSeT 或 PXGL 培养条件，细胞被传代至经丝裂霉素 C 失活的 CF-1 MEFs（3×10
为构建 Piggyback 质粒，按照制造商说明，使用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（M0530S，New England BioLabs）以带有 AttB 末端延伸序列的人细胞系 cDNA 为模板扩增全长编码序列。扩增产物按照制造商说明，使用 BP clonase（11789100，ThermoFisher Scientific）导入 pDONR221 入门质粒，随后再使用 LR clonase（11791020，ThermoFisher Scientific）导入目标质粒。采用 Neon 转染系统并使用以下参数对 hESCs 进行电转：1200 V，2 ms，2 个脉冲。电转质粒包括 GATA6-3XFLAG-TetOn-Zeo（入门质粒 72922，Addgene）和/或 SOX17-TetOn-Hygro 或 GATA3-EGFP-TetO-Hygro（Dr. Mika Drukker 惠赠）和/或 TFAP2C-TetOn-G418，此外还包括 PB-CAG-rTTA3-Bsd 或 PB-CAG-rTTA3-Zeo，以及表达 PiggyBac 转座酶的 pBase 质粒。转染两天后，以 1/4 剂量加入抗生素，并逐步增加至终浓度：100 µg/mL zeocin（ant-zn-1，Invitrogen）、20 µg/mL blasticidin（A113903，ThermoFisher Scientific）、50 µg/mL G418（10131035，ThermoFisher Scientific）或 50 µg/mL Hygromycin B（10687010，ThermoFisher Scientific）。克隆通过在体视显微镜下手动挑取单个菌落获得。通过加入 1 µg/mL 盐酸多西环素（doxycycline hyclate，D9891，Sigma）诱导转基因激活。需要注意的是，AP2γ 诱导型细胞在 PXGL naïve 条件下未能重置。
收集细胞沉淀后，按照制造商说明使用 Qiagen RNeasy 试剂盒提取 RNA。使用 1 µg RNA 进行逆转录反应，所用试剂包括随机引物（C1181，Promega）、dNTPs（N0447S，New England BioLabs）、RNA 酶抑制剂（M0314L，New England BioLabs）以及 M-MuLV 逆转录酶（M0253L，New England BioLabs）。RT-qPCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（4368708，ThermoFisher Scientific）在 Step One Plus 实时 PCR 仪（Applied Biosystems）上进行。程序设置如下：95°C 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95°C 15 秒和 60°C 1 分钟。本研究中所使用的所有引物均观察到单一熔解曲线。
为构建植入后胚胎的三维干细胞来源模型，将转换至 RSeT 培养基后传代 2 至 6 次的 RSeT 细胞按常规进行传代；次日（第 -3 天），胚外样细胞（诱导 GATA6、诱导 GATA6-SOX17 或诱导 GATA3-AP2γ）的培养基更换为含 5% Knockout Serum Replacement 和 1µg/mL DOX 的 N2B27。该培养基每 24 小时更换一次，持续 3 天。第 0 天（聚集当天），通过预包被抗黏附溶液（07010, STEMCELL Technologies）并以 2000g 离心 5 分钟来制备 Aggrewell 培养皿（34415, STEMCELL Technologies）。在加入实验培养基前，用 PBS 清洗孔两次。该培养基由含 5% knockout serum replacement、1µg/mL doxycycline 和 10µM Y-27632 的 N2B27 组成。向用于诱导人胚样体生成的含细胞孔中加入 10µM Y-27632 后 1 小时，对诱导细胞和野生型 ESC 进行酶解离。解离后的细胞经沉淀后重悬于实验培养基中，并置于明胶包被孔中以去除 MEF。15–30 分钟后，对细胞进行计数、混合，并接种至 Aggrewell 培养皿中，最终按每个 Aggrewell 微孔接种 8 个野生型 ESC、8 个下胚层样细胞和 16 个滋养层样细胞进行计算。第 1 天，将培养基进行两次、每次更换三分之二，更换为含 5% knockout serum replacement 和 1µg/mL doxycycline 的 N2B27。第 2 天，对 Aggrewell 进行半量换液，换为含 1.25 µg/mL hIGF1（78022.1 STEMCELL Technologies）和 1µg/mL doxycycline 的 hIVC1 培养基。hIVC1 培养基由 Advanced DMEM/F12（12634-010 ThermoFisher Scientific）补充 20% 灭活 FBS（10270106, ThermoFisher Scientific）、1x Glutamax、1X NEAA、1x Essential AA、1x ITS-X、25U/mL Pen/Strep、1.8mM 葡萄糖（G8644, Sigma-Aldrich）、0.22% 乳酸钠（L7900, Sigma-Aldrich）、8nM β-雌二醇（50-28-2, Tocris）和 200ng/mL 孕酮（P0130, Sigma-Aldrich）组成。自第 3 天起，每天均使用该培养基进行半量换液。第 4 天，在体视显微镜下使用口吸管手动挑取聚集体，转移至超低吸附 96 孔板（CLS7007, Corning）的单个孔中，并在上述含 IGF1 和 doxycycline 的 hIVC1 培养基中继续培养。
样本用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗后，于室温下用 4% 多聚甲醛（PFA；1710, Electron Microscopy Sciences）固定 20 分钟。随后用 PBS + 0.1%（vol/vol）Tween-20（PBST）清洗样本 3 次，并在室温下于 PBS 中用 0.3%（vol/vol）Triton X-100（T8787, Sigma Aldrich）+ 0.1mM 甘氨酸（BP381-1, Thermofisher Scientific）孵育 30 分钟。样本随后在封闭液中封闭（PBST 含 5%（w/vol）BSA，A9418, Sigma），之后在 4°C 下用封闭液稀释的一抗孵育过夜。见
人胚胎按先前描述的方法复苏并培养
统计分析使用 GraphPad Prism 9 进行。样本量未预先确定，且作者在实验条件方面未实施盲法。所有实验均至少独立重复两次。在图中，所有数据均以均值 ± SEM 表示。
为收集用于单细胞测序的着床后胚胎模型，在第 4、6 和 8 天通过目视挑选组织结构正确的 embryoid，并在 4 孔板中用 PBS 清洗两次后转移至 TrypLE 中。样本每 5 分钟通过吹打混匀一次，持续 10–20 分钟直至解离。随后通过加入 2 倍体积、含 20% FBS 的 PBS 终止酶活性。将细胞收集至 Falcon 管中，离心沉淀后重悬于冻存缓冲液中。该缓冲液由以下成分组成：50 mM Tris（pH 8.0；15-567-027，Fisher Scientific）、25% 甘油（G5516，Sigma-Aldrich）、5 mM Mg(OAc)2（63052，Sigma-Aldrich）、0.1 mM EDTA（15575020，ThermoFisher Scientific）、5 mM DTT（R0861，ThermoFisher Scientific）、1× 蛋白酶抑制剂混合物（P8340，Sigma-Aldrich）以及 1:2500 稀释的 superasin（AM2694，Invitrogen）。对于细胞系，计数 10,000 个细胞后离心沉淀，并重悬于上述冻存培养基中，随后于 -80°C 缓慢冻存。
对于细胞核分离和文库构建，采用了 10x Genomics 的低输入细胞核分离方案。简而言之，将冻存细胞沉淀在 37°C 水浴中复温 30 秒，随后离心（4°C，500g，5 分钟）使细胞沉淀，再吸除上清液。细胞沉淀用 200 µl 含 0.04% BSA 的 1× PBS 清洗两次，每次清洗之间均进行离心并吸除上清。随后，向清洗后的细胞沉淀中加入预冷裂解缓冲液（每个样本 45 µl），置于冰上 3 分钟，然后加入洗涤缓冲液（每个样本 50 µl）。洗涤后的分离细胞核重悬于稀释的细胞核缓冲液中。在本研究中，分离的细胞核重悬于 5 µl 稀释细胞核缓冲液中，并直接加入转座反应。在后续所有步骤中，均按照制造商的规范和指南，遵循 10x Genomics Single Cell Multiome ATAC and Gene Expression 方案。最终文库加载至 NextSeq 2000 平台，使用 P2 100 cycle 试剂盒，加载浓度为 650 pM，采用双端测序，并遵循 10x Genomics 推荐的测序读长设置（基因表达文库为 28/10/10/90 cycles，ATAC 文库为 50/8/24/49 cycles）。
原始读段使用 CellRanger ARC 流程进行分析，以为每个样本生成 ATAC 和 RNA 的 fastq 文件，并进一步比对基因组和转录组读段。随后将矩阵读入 Seurat。
我们采用了近期发表的一种用于 velocity 计算的方法，该方法同时考虑单细胞 ATAC 和 RNA 数据。
使用 CellPhoneDB 2.0 的默认设置评估潜在的组织信号传导串扰。
Yan 等人、Blakely 等人、Petropolous 等人、Zhou 等人和 Xiang 等人此前发表的数据，使用 kallisto 或 kb-bustools 重新比对至 hg38 人类基因组。
本研究产生的数据可在 Gene Expression Omnibus 中获取，登录号为 GSE218314。为便于审稿，可使用令牌 ijkhciquzhubbqt 访问该数据集。
此前发表的数据可公开获取：人类数据
Molè 等，2021：ArrayExpress E-MTAB-8060
Xiang 等，2020：Gene Expression Omnibus GSE136447
Zhou 等，2019：Gene Expression Omnibus GSE109555
Petropoulos 等，2016：ArrayExpress E-MTAB-3929
Blakely 等，2015：Gene Expression Omnibus GSE66507
Yan 等，2013：Gene Expression Omnibus GSE36552
Yang 等，2021：Gene Expression Omnibus GSE148683
Ma 等，2019：Gene Expression Omnibus GSE130114
Nakamura 等，2016：Gene Expression Omnibus GSE74767
用于分析这些数据的代码可在以下位置获取
B.A.T.W. 和 C.W.G. 设计、实施并分析了实验。B.A.T.W.、C.W.G. 和 L.K.I-S. 开展了人类胚胎相关工作。N.H. 和 R.M.D. 制备了 10x multiome 文库，并在 J.S. 的指导下完成了 RNA 和 ATAC 测序。B.A.T.W. 分析了单细胞测序数据。C.W.G. 和 B.A.T.W. 在所有共同作者的意见支持下撰写了手稿。M.Z-G 构思并指导了该项目。
M.Z-G、B.A.T.W 和 C.W.G 是题为“Stem Cell Derived-Model of the Human Embryo”的专利发明人。
(A) 在围植入期人类胚胎发育过程中，使用 SCENIC 推断得到的上胚层、下胚层和滋养层基因调控网络。有关数据集和处理流程的详细信息见方法部分。(B) 采用 SCENIC 对下胚层标志物 GATA6、SOX17 以及 TrB 标志物 GATA3 和 TFAP2C 的 regulon 活性进行评分。(C) 在三种多能性状态下，分别或联合诱导 GATA6（iG6）、诱导 SOX17（iS17）或诱导 GATA6-SOX17（iG6-S17）3 天后的 qRT-PCR 分析。N=3 个生物学重复，每个生物学重复含 3 个技术重复。(D) 在多种多能性起始状态下，DOX 诱导诱导型 GATA3（iG3）、诱导型 AP2γ（iAγ）或诱导型 GATA3-AP2γ（iG3-Aγ）3 天后的 qRT-PCR 分析。N=3 个生物学重复，每个生物学重复含 3 个技术重复。注意，在 (C) 和 (D) 中，诱导转基因以红色标示。
(A) 对可诱导 GATA6（iG6）、可诱导 SOX17（S17）或可诱导 GATA6-SOX17（iG6-S17）细胞在多种多能性状态下诱导 3 天后的免疫荧光分析。(B) 对 A 的定量分析。(C) 对可诱导 GATA3（iG3）、可诱导 AP2γ（iAγ）或可诱导 GATA3-AP2γ（iG3-Aγ）在多种多能性状态下诱导 3 天后的免疫荧光分析。注意，在 (B) 和 (D) 中，诱导转基因以红色标示。所有实验均为 N=2 次独立实验中的 3 个技术重复。
(A) 在卵黄囊样细胞（Activin-A、CHIR99021 和 LIF）定向分化、多西环素介导的可诱导 GATA6-SOX17 细胞诱导，或两者联合处理后，对 GATA6、SOX17 和 SOX2 进行比较与定量。细胞在 RSeT 条件下分化获得。 (B) 在卵黄囊样细胞（Activin-A、CHIR99021 和 LIF）定向分化、多西环素介导的可诱导 GATA6-SOX17 细胞诱导，或两者联合处理后，对 EOMES、N-Cadherin 和 OTX2 进行比较与定量。N=2994 个细胞。 (C) 在 PA（PD0325901 和 A83-01）或 PAL（PD0325901、A83-01 和 LPA）定向分化、多西环素介导的可诱导 GATA3-AP2γ 细胞诱导，或两者联合处理后，对 GATA3、AP2α 和 SOX2 进行比较与定量。 (D) 在 PA（PD0325901 和 A83-01）或 PAL（PD0325901、A83-01 和 LPA）定向分化、多西环素介导的可诱导 GATA3-AP2γ RSeT 细胞诱导，或两者联合处理后，对 GATA2、KRT7 和 AP2γ 进行比较与定量。N=2368 个细胞。分化在 RSeT 条件下的人胚胎干细胞（hESC）中进行。
(A) 对野生型、可诱导 GATA6-SOX17 和可诱导 GATA3-AP2γ RSeT hESC 群体测序后，在多西环素诱导 3 天时所选基因的 UMAP 投影。诱导在 RSeT 条件下的人胚胎干细胞中进行。
(A) 用于测序的可诱导人胚样体在第 4、6 和 8 天选取的明场图像（每个阶段 n=12）。注意可见一个内部区域被两个同心区域所包围。 (B) 该干细胞来源模型中上胚层、内胚层和中胚层，以及滋养层和羊膜的代表性标志基因表达。 (C) 将可诱导人胚样体细胞投射到食蟹猴上的 scmap 投影（
(A) HAND1 的免疫荧光显示其在 GATA6 阳性细胞（推定的胚外间充质）中表达，并且在推定羊膜（AP2γ 阳性）中其表达于第 4 天至第 6 天之间上调。 (B) 的表达
(A) 使用 CellPhoneDB 生成的簇间预测相互作用图谱。 (B) 可诱导 GATA6-SOX17（G6-S17）和可诱导 GATA3-AP2γ（G3-AP2γ）细胞在诱导 3 天后与野生型 RSeT hESC 的预测相互作用，后者为聚集生成可诱导人胚样体的细胞类型。 (C) 若排除诱导的 GATA3-AP2γ 细胞，则无法形成可诱导人胚样体。 (D) Aggrewell 整体概览显示 BMP 抑制对 NODAL 激活的影响。注意到在 BMP 抑制后，表达 SOX2 的组织良好结构显著增加。
(A) 聚集后第 6 天 CER1 和 SOX2 的免疫荧光显示，在由可诱导 GATA6（iG6）或可诱导 GATA6-SOX17（iG6-S17）下胚层样细胞与野生型 ESC 及可诱导 GATA3-AP2γ（iG3-AP2γ）细胞共同生成的结构中，此阶段 SOX2 和 CER1 均下调。
作者感谢 CARE Fertility、Herts and Essex Fertility Centre、Bourn Hall Fertility Clinic 和 King’s Fertility Clinic 在捐赠多余人类胚胎方面的合作。作者感谢 M.Z-G 实验室和 Boroviak 实验室的所有成员，感谢 Gianluca Amadei 提出的深思熟虑的意见，以及 Marta Shahbazi 和 David Glover 对稿件提出的反馈意见。本研究获得了 Wellcome Trust、Open Atlas 和 NOMIS 授予 M.Z-G 的资助，Allen Discovery Center for Cell Lineage Tracing 授予 J.S. 和 M.Z-G. 的资助，此外还获得了 Gates Cambridge Trust 对 B.A.T.W. 的个人资助以及 Leverhulme Trust Early Career Fellowship 对 C.W.G. 的资助。J.S. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545082
🏷️ 人胚胎模型 胚胎干细胞 类胚体 转基因诱导 胚外谱系 自组织发育