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转录组学的突破正提供令人振奋的新方法，用于表征生物体内细胞多样性。
细胞是生命的基本单位。转录组学的进展如今使得以空前的分辨率表征生物体内的细胞多样性成为可能。
表征结构多样性的一个重要步骤，是开发诸如光片显微镜等先进成像方法，这些方法能够以单细胞分辨率对整个发育中的生物体进行标准化成像。
缺乏用于比较多细胞结构的方法，尤其阻碍了对组织多样化遗传调控机制的研究。在细胞尺度上，形态发生主要由肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架驱动，并受普遍存在于所有细胞中的 RhoA GTP 酶调控。在组织尺度上，细胞骨架活动通过细胞-细胞黏附相互连接，从而协调细胞形态塑造，并生成多种器官功能所需的特定多细胞结构。这表明，细胞黏附分子，尤其是钙黏蛋白的模式化表达，可能使组织组织方式发生受遗传调控的改变。长期以来，钙黏蛋白因其在维持组织完整性中的作用而受到研究，而钙黏蛋白表达的变化则是退行性疾病和癌症的标志性特征。
在本研究中，我们提出了一种量化组织多样性的通用方法，即将组织复杂性简化为其组成细胞的三维排列，“关注森林而非树木”。通过对整个胚胎进行细胞核分割，我们在一个基于点云的统一框架内定义了细胞位置。点云是许多空间分析任务中的标准数据结构，这使得我们能够以不依赖细胞类型的方式，对发育中组织的组织结构进行比较分析。这种粗粒化方法使我们能够随时间追踪组织组织方式，并将组织特征与基因表达相关联。对组织方式相似的细胞进行无偏聚类显示，组织异质性可被归纳为两种组织“原型”，我们依据材料科学中的标准将其命名为“非晶态”和“晶态”。界定这种
为了能够研究整个发育中生物体的组织多样性，我们最初聚焦于受精后 48 小时（hpf）的斑马鱼胚胎，这一阶段若干主要器官的祖细胞已经形成。
a：多视角光片显微镜成像和细胞核分割将整体体积图像数据转换为点云表示。 b：对于每个细胞，多细胞组织由一个十四维特征向量表示，该向量描述局部点分布。需要注意的是，显式坐标并不属于该特征集的一部分。 c：对组织特征进行相似性聚类揭示了三类特征：各向异性、密度和不规则性。 d：组织特征类别的空间分布彼此不同，并突出显示了不同的解剖区域。此外，在组织特征空间的 t-SNE 嵌入中，各特征类别表现出不同的分布。 e：组织特异性的基因表达模式被映射到点云表示上；基于标记的荧光强度（HCR、转基因系），将单个细胞核分类为表达/不表达。 f：平均组织特征谱量化了组织多样性。 g：叠加基因表达模式的组织特征空间 t-SNE 嵌入图。特征值在多个样本的所有细胞中进行了 z 分数标准化。 N：样本数量，n：细胞总数
为了描绘整个胚胎的组织图谱，我们使用 nuQLOUD 对主要组织的组织结构进行表征和比较，包括皮肤、脑、肌肉和结缔组织（
随后，我们将 nuQLOUD 分析从由基因表达定义的器官扩展到斑马鱼胚胎发生多个时期的所有细胞，以识别和分析典型的组织模式。具有共同组织特征的细胞通过高斯混合模型被归为十一种“组织基序”（
a,b：组织多样性随时间增加。采用高斯混合模型（GMM）将组织特征空间划分为11种“组织基序”。利用四个不同发育时间点的数据可见，一些基序在早期发育过程中始终存在（如III、VI、IX），而另一些则随时间逐渐形成（如I、II、VII）（a）。组织特征值经z分数标准化，并对所有时间点的数据同时进行聚类。b展示了两个组织基序的示例。基序I在早期不存在，细胞自24 hpf起开始按该基序组织，最终覆盖中枢神经系统（CNS）；基序IX则持续定位于卵黄合胞层（YSL），并在48 hpf时还包括中位鳍褶。特征空间表征（t-SNE）基于所有时间点生成。n：所示样本中每种基序的细胞数。c-e：结构多样性可归纳为两种组织原型。c 基于组织结构对组织基序进行层次凝聚聚类（HAC），识别出两种“原型”，它们映射至组织特征空间的相对两侧，并由相反的组织特征所定义。“无定形”原型的细胞组织呈致密、各向同性且不规则，而“晶体状”细胞则呈低密度、各向异性且规则排列。该聚类采用48 hpf数据。特征值经z分数标准化。HAC采用欧氏距离和Ward连接。d,e：48 hpf时，组织原型在空间上映射为连贯区域。CNS、感觉器官和胸鳍芽的细胞呈无定形组织，而肌肉、皮肤和YSL则呈晶体状组织。e中表达组织特异性标记的细胞除成纤维细胞外，均归属于两种原型之一。n：N=34个样本中每种基序的平均细胞数 ± 均值的标准差。
为理解组织结构的更高层次模式，我们研究了组织基序之间的相互关系。根据组织相似性对基序进行聚类后，揭示出两类模式，我们将其称为组织“原型”，在48 hpf时各自约占胚胎细胞总数的50%。基于其组织特征谱，我们发现这两种原型符合材料科学中“晶体状”和“无定形”的定义（
为鉴定可能调控这种向两种原型分化的组织二分模式的遗传调控因子，我们考察了钙黏蛋白家族这一细胞黏附受体家族；该家族是维持组织完整性以及基于差异黏附的细胞分选的重要调控因子。
a：在点云表征上对钙黏蛋白表达域进行映射；根据标记物（HCR）的荧光强度，将单个细胞核分类为表达/不表达。选择在全部细胞中表达比例超过1%的钙黏蛋白（补充图10a）。 b：特异性钙黏蛋白表达域占据组织特征空间中的不同区域。各表达域要么定位于左半球，要么定位于右半球。 c：基于组织特征的聚类揭示了两类钙黏蛋白表达细胞。表达域的平均特征值经过z评分标准化。 d：这两类钙黏蛋白映射到特征空间中彼此离散的两半，并且分别主要包含于无定形和晶体型原型之中。 e：这两类钙黏蛋白映射到组织原型。尺度：与原型相关联的细胞百分比；青色/橙色表示100%关联，白色表示各占50%。 f：基于单细胞RNA测序数据，对钙黏蛋白表达域进行自相关聚类。
为进一步研究钙黏蛋白表达与组织原型之间的联系，我们对钙黏蛋白表达域的组织结构进行了动态分析。我们的推理是，如果钙黏蛋白调控组织结构，那么它们应当随时间维持其组织特征谱。因此，我们选择E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白（cdh1、cdh2，E-/N-Cad）作为分别代表无定形和晶体型组织化钙黏蛋白类别的代表，并利用转基因报告系统追踪其表达模式（TgCRISPR(cdh1-mLanYFP)
a、b：E-cad 和 N-cad 的表达模式在定性上分别与晶态和非晶态原型相吻合。灰点：不表达细胞；未显示双阳性细胞。 c：在整个早期发育过程中，cdh1/2 与晶态/非晶态组织方式的关联始终得以维持。N=4 个样本/时间点。每个时间点非晶态与晶态群体的 P 值：
12 hpf 时的细胞，此后从 48 hpf 起逐渐集中于中枢神经系统（CNS）细胞及其他部分组织的一个子集（
为更详细地检验这一点，我们随后在单一组织内研究了这种关系，重点关注 12 至 48 hpf 期间发育中的快缩肌。这是一个研究较为深入的形态发生系统，表现出动态变化的 cadherin 表达：早期 N-cad 呈均一表达，随后则局限于表层慢肌细胞。
N-cad表达下调能够使组织从无定形组织过渡到更具晶体样的组织，这一发现预示着，诸如中枢神经系统（CNS）等持续高水平表达N-cad的组织，可能需要这种持续表达来维持其无定形原型。为检验这一假设，我们将对N-cad敲除（KO）的分析扩展至12至48 hpf的整胚胎，起始于N-cad刚达到其完全表达的发育阶段（补充图15a）。在12 hpf时，表现出无定形组织的细胞比例显著下降，而晶体样组织增加（
a-c：N-cadherin敲除降低了12 hpf时无定形组织的频率。a：未注射（对照）与N-cadherin KO胚胎的代表性重建图；12 hpf，细胞核经分割并按原型着色。KO通过在胚胎发育1细胞期注射Cas9 + 针对N-cadherin的sgRNA实现。与对照相比，KO中无定形组织的细胞比例下降约30%（b），而两种条件下的细胞数量无显著变化（c）。d：N-cadherin的嵌合敲除（mKO）通过在胚胎发育8细胞期向单个细胞注射Cas9 + sgRNA实现。通过组合标记鉴定被操作的细胞：在WT条件下，CNS细胞共表达NBT和N-cadherin；mKO细胞丢失N-cadherin，仅表达NBT。e：mKO效率较高，使NBT+细胞中N-cadherin+细胞的比例从约98%降至约34%。f：全脑光片显微镜证实了形态学表型，并提示mKO克隆中的组织结构发生改变。比例尺：概览图200 µm，放大图15 µm。g：将NBT+细胞投影到组织特征空间表征中，显示仅在N-cadherin mKO细胞中出现向晶体样组织的原型性偏移。对每个样本中分割得到的细胞核组织进行定量，随后与整体组织特征空间进行对齐。N：样本数，n：分析细胞总数。h：与N-cad+细胞相比，N-cad mKO细胞中晶体样组织的细胞比例显著增加；后者的组织方式与对照胚胎中的N-cad+细胞相比无显著差异。i：向晶体样组织的偏移由细胞密度降低和规则性增加所驱动。所示p值通过Welch t检验计算。
光学显微技术和转录组学的进展，已使从类器官到各种实验系统中组织异质性的研究兴趣激增
nuQLOUD方法的目标之一，是提供一种在整个有机体尺度上定义组织组织方式的新方法。诸如上皮-间充质范式这类关于组织状态的通用描述极具威力，因为它们能够在多种生物学语境之间实现概念和机制的迁移
nuQLOUD 提供的组织构型定量读出使我们能够探索钙黏蛋白表达与组织构型原型之间的关系。将 12 种主要钙黏蛋白的空间表达数据整合到 nuQLOUD 框架中后，揭示出两个不同的群组：与晶态组织相关的钙黏蛋白，如 E-cad；以及与非晶态组织相关的钙黏蛋白，包括 N-cad。时间分辨分析表明，N-cad 表达与非晶态原型高度相关：在早期阶段，大多数细胞表达 N-cad，随后随着细胞经历由非晶态向晶态的转变，N-cad 被更具组织特异性的钙黏蛋白所取代。相比之下，神经系统细胞在所研究的所有阶段均表现出高水平的 N-cad 表达和非晶态原型组织特征，这与其在神经发育中的既有作用一致。无论是通过正常发育过程中的下调，还是通过靶向扰动导致的 N-cad 缺失，都会使细胞的组织构型由非晶态切换为晶态，从而确定 N-cad 是非晶态原型的核心调控因子。这些数据支持这样一种模型：N-cad 的下调以及脱离非晶态原型，代表了一种调控非神经组织组装的共同门控机制。有趣的是，近期研究表明，N-cad 功能失活会提高体外培养的哺乳动物原肠胚样体的自组织潜能。
当前的 nuQLOUD 框架并非没有局限性。首先，它假定在某一特征长度尺度上存在连续排列，通常为 Delaunay 图上的一个最近邻。尽管这一假设适用于分析尺寸超过约 30 µm 的组织，但对于狭窄结构，如血管，则并非最优。
斑马鱼（Danio rerio）品系按照标准程序进行维持、饲养和繁殖，具体方法见
自受精后 24 小时（hpf）起，胚胎以 0.002% N-苯基硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）处理以防止色素形成。为在筛选过程中固定 24 hpf 以上的胚胎，对其使用 0.01% 甲磺酸三卡因（MS222，Sigma-Aldrich）处理。此外，在固定前使用高浓度三卡因（300 mg/L）对胚胎实施安乐死。为辅助并加速 24 至 48 hpf 胚胎的脱膜处理，使用 0.05% 链霉蛋白酶进行处理。
为在活体且无需染色的条件下可视化基因表达，使用了转基因斑马鱼品系。神经系统采用 Tg(NBT:DsRed) 进行可视化。
在成像之前，对于48 hpf之前阶段的斑马鱼胚胎，使用Dumont #5镊子手动去除卵膜；更晚时间点的胚胎则已自行孵化。胚胎采用tricaine安乐死，并在室温下置于1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%多聚甲醛（PFA）中固定1小时。随后，样品用PBS Tween（PBS + 0.05% Tween-20，Thermo Fisher Scientific，PBS-T）冲洗3次，在PBS Triton（PBS + 0.1% Triton X-100，Thermo Fisher Scientific）中通透处理1小时，并再次用PBS-T冲洗。样品的细胞核通过在室温下用1X 4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）处理2小时进行染色。染色后，样品用PBS-T冲洗，储存在4°C的PBS-T中，并在14天内完成成像。
为了鉴定表达目标基因的细胞，我们采用杂交链式反应RNA荧光原位杂交（HCR RNA FISH）对其转录本进行标记。
F0敲除通过将sgRNA/Cas9混合物注射到早期阶段斑马鱼胚胎中生成。sgRNA序列总结见（补充表2）。注射混合物由Cas9-2xNLS蛋白（1 mg/µL）、sgRNA（128 ng/µL）和酚红（0.025%）组成。完全敲除通过在胚胎发育1细胞期向卵黄中注射1–2 nL注射混合物实现；嵌合敲除（mKO）则通过在发育8细胞期向其中一个细胞注射实现（25°C下受精后约1小时10分钟）。Cas9蛋白购自欧洲分子生物学实验室（EMBL）蛋白表达与纯化核心设施，并以含有Hepes、KCl和甘油的培养基在-80°C保存。
为了验证sgRNA的有效性，对所用sgRNA同源区域进行扩增和测序，以检测DNA序列多态性。为此，将注射后的胚胎培养至4 dpf，并使用tricane安乐死。使用40 µL QuickExtract DNA提取液（Lucigen QE0905T）从单个样品中提取基因组DNA。胚胎分别在25°C孵育15分钟、65°C孵育5分钟和95°C孵育2分钟，并在各孵育步骤之间进行涡旋振荡。随后，以13,000 rcf离心1分钟去除固体碎屑。为了扩增sgRNA同源区域，使用软件工具Primer3设计侧翼引物对。
样品通过使用Transferpettor活塞杆（BRAND，Merck）将其头部朝前吸入20 µL玻璃毛细管（BRAND Transferpettor caps，Merck）中，并包埋于1X E3鱼胚培养液中的1%低熔点琼脂糖溶液内。
光片显微成像在Zeiss Z.1 Lightsheet显微镜上进行。所有图像均使用Zeiss W Plan Apochromat 20×1.0校正型水浸物镜和一对Zeiss 10×照明显微物镜采集。对于
对于整胚采集，样本从四个相互正交的方向进行成像，首先采用侧视图，此时样本的腹背轴自左向右延伸；随后沿样本的前后轴按顺时针方向每次旋转90°继续成像。对于12 hpf样本，一个这样的成像体积即可足以捕获整个样本。对于发育程度更高的样本，则沿样本的前后轴采集多个彼此重叠（10%–20%）的四视角成像体积；24 hpf：2个体积，48 hpf：4个体积，72 hpf：5个体积。连续帧之间的z轴间距为1 µm，且对于每一帧，左侧和右侧光片照明分别记录。采集过程见补充图1。采集过程中，开启了“Pivot Scan”选项以减少照明伪影。通过对比度最大化，对每个样本分别手动校准光片偏移。照明设置的选择以尽量缩短采集时间为原则。为避免在设置过程中发生光漂白，空间配准和多视角设置使用DAPI通道完成。其他荧光通道则通过单帧采集进行设置。多色成像按顺序进行，并优先于颜色的是z-stack，即以单一颜色重复采集完整的z-stack。因此，整个成像过程可概括为：光片方向 → z-stack → 颜色 → 体积 → 平铺块。
原始光片图像以czi（Zeiss）文件格式存储。MVRegFus软件包（可获取于
使用Tracking with Gaussian Mixture Models（TGMM 2.0）软件，从体积显微图像中对单个细胞核进行三维分割
使用软件voro++的修改版本生成三维Voronoi图
早期斑马鱼发育的单细胞RNA测序数据获取自
除非另有说明，统计显著性采用非参数检验进行检测。对于非配对样本，采用Mann-Whitney U检验；对于配对样本，采用Wilcoxon符号秩检验。除非另有说明，N表示样本数（重复数），n表示细胞数（观测数）。在统计分析中，观测值按样本分组。
箱线图通过显示其中位数（中心线）、四分位距（箱体）、1.5倍四分位距（须）以及离群值（异常点）来展示数据分布。除非另有说明，柱状图中的误差线表示均值的标准差。
对于低维嵌入，使用了t-SNE或UMAP。t-SNE表征按照
支持本研究结论的所有数据均可在本文及其补充文件中获取，或可在合理请求下向通讯作者获得。所有原始光片数据（多视角融合后）均可在BioImage Archive中获取（
MB 和 DG 构思了该项目并设计了实验。MB 完成了所有实验，进行了光片显微成像、图像分析、nuQLOUD 软件开发以及数据分析。MA 开发了多视角融合软件。MB 和 JJ 实施了 F0 CRISPR 基因敲除。RB 提供了转基因斑马鱼品系并优化了 HCR 染色。MB 和 DG 对数据进行了解释，并在所有作者的意见基础上撰写了手稿。
感谢 Francesca Peri 及其实验室、François Nédélec、Damian Brunner、Jana Wittmann 以及 Gilmour 实验室全体成员的讨论。感谢 Cornelia Henkel 负责鱼类饲养。感谢苏黎世大学显微与图像分析中心的 Urs Ziegler、Jana Döhner 和 Joana Delgado Martins 在图像采集与分析方面提供的支持及基础设施。感谢 Kim Remans 和欧洲分子生物学实验室蛋白表达与纯化核心设施提供 Cas9。感谢 Mark Cronan 和 David Tobin 提供 E-Cad 报告品系。感谢 DG 获得的 SNSF 176235 号资助以及 MB 获得的苏黎世大学 Forschungskredit FK-21-084 号资助。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.06.626808
🏷️ 胚胎发育 组织多样性 细胞排列 钙黏蛋白 三维成像 形态发生