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由于植入后人类胚胎在子宫内发育所涉及的伦理与技术挑战，我们研究人类早期植入后发育的能力仍然受到极大限制。尽管在人类原肠胚样体、轴体样结构以及体外培养的囊胚样体方面已取得重大进展，但这些精巧的模型并不构成一种整合性的干细胞来源胚胎模型（SEMs），因为它们未包含早期植入后人类孕体的所有关键胚外组织（例如，下胚层、卵黄囊、滋养层、羊膜和胚外中胚层），因此也无法在这些胚外区室的背景下重现植入后上胚层的发育。近期研究表明，小鼠初始态多能干细胞（PSCs）能够产生胚胎性与胚外胚层干细胞，这些细胞可自组装形成原肠运动后阶段的小鼠SEMs，绕过类囊胚阶段，并最终启动器官发生。
由于难以获得人类妊娠这些早期阶段的相关胚胎样本，以及存在技术和伦理方面的挑战，我们对人类早期植入后发育的理解一直受到限制。
在培养条件下捕获处于不同发育状态的人类多能干细胞（PSCs）的能力。
近期研究表明，小鼠PSC具有可被诱导的能力。
在小鼠中，获得包含关键胚胎与胚外区室的SEMs需要最佳培养条件，以及从初始态多能干细胞（PSC）快速高质量诱导原始内胚层（PrE）和滋养外胚层（TE）；这一点分别通过异位表达Gata4和Cdx2得以成功实现。
因此，我们首先着手建立一个类似的平台，以通过在人类初始态PSC中瞬时表达这些转基因来获得胚外谱系（
由于在小鼠中，ACTIVIN A并非细胞向PrE预备化所必需。
我们的下一步是检验在RCL诱导方案中是否存在PDGFRa+ PrE和/或ExEM细胞，并区分二者。免疫染色和RT-PCR分析均证实，在RCL条件下内源性表达了PrE标志基因，包括仅标记PrE亚群的SOX17，以及GATA4、GATA6和NID2基因（
与此同时，我们着手寻找用于获得滋养外胚层（TE）谱系细胞的最佳条件，使其能够与其他谱系充分聚集，并发育为植入后阶段的人类SEMs。
在小鼠SEM模型中，已建立的胚胎来源TSC细胞系在聚集过程中可以替代iCdx2诱导的PSC，而不影响最终结果。
近期研究提示，GATA3在人类TE诱导过程中可能具有重要作用。
为了更详细地研究我们的人类SEMs发育过程，并获得适当的参照，我们主要依赖于“虚拟人类胚胎项目”的数据。该项目基于胚胎Carnegie分期，是迄今最为详尽且最具相关性的可用资料来源。
在人类和非人灵长类动物（NHP）中，内细胞团分离为两个谱系：上胚层（Epi），由表达 OCT4 的柱状细胞构成。
在人类胚胎植入后早期、原肠形成前阶段，已存在部分胚外中胚层（ExEM）。
在人类胚胎发育至 11–12 dpf（CS5c）时，胚盘分离为腹侧假复层上胚层和背侧鳞状羊膜（Am）。
随后，我们旨在更详细地表征 SEM 中关键谱系的发育。由于上胚层来源于初始的 naïve PSCs，我们检测了其在与其他谱系共聚集并置于 N2B27 基础培养条件后是否发生 priming。确实，在共聚集后不久，我们观察到 naïve 标志基因（DNMT3 和 STELLA）的表达丧失，而这些基因最初在 HENSM 条件下的起始 naïve PSCs 中表达。
在哺乳动物中，前后（AP）轴的早期出现较为普遍，其特征是部分 Epi 细胞在胚盘预定后侧开始启动 BRACHYURY（T）的表达。
自第 6 天起，Epi 显示出早期羊膜囊形成的模式化，表现为与推定羊膜相对应的背侧鳞状细胞群，以及腹侧柱状假复层上胚层细胞。
在人类中，卵黄囊在 CS4 与 CS5 之间开始由下胚层形成。位于上胚层下方的下胚层部分（形成特征性的双层胚盘）属于内脏内胚层（VE），并且是上胚层模式化的动态信号中心。它与壁内胚层（PE）相连，共同形成内部腔隙——初级卵黄囊（PYS），该结构在发育过程中会发生重组。
接下来，我们旨在表征上述位于卵黄囊下方的 OCT4 阴性且 SOX17 阴性的细胞群。
人类和 NHP 胚胎的组织学描述表明，随着 ExEM 的扩张，PYS 腔发生重塑，随后 PYS 残余部分发生缩颈分离并囊泡化，最终形成次级卵黄囊（SYS）。
滋养层发育的腔隙期大约始于 14 dpf，此时滋养层合体内出现充满液体的间隙，这些间隙相互融合并将滋养层分隔为小梁结构。
滋养层合体的另一项重要功能是分泌激素，如人绒毛膜促性腺激素 β（HCGB），其维持妊娠的多种生理方面。针对 HCGB 的免疫染色表明，在 SEM 周围的滋养层细胞中该激素蛋白丰富存在，并在细胞内囊泡中富集。
为了以更为无偏的方式进一步验证并考察本文所构建的人类SEM中存在的细胞类型环境，我们对选取的第4、6和8天SEM进行了基于Chromium 10X scRNA-seq的单细胞转录组分析。我们分析了这些实验时间点经人工挑选并汇集的高质量SEM中约4,000–8,000个细胞。经过质量控制和严格筛选后，共有12,190个单细胞被用于后续分析（
在4个已注释的Epi簇中（均在表达OCT4（POU5F1）和SOX2的同时表达CD24这一预备态多能性标志物（
在3个不同的卵黄囊（YS）簇中，这些簇共同表达GATA4、GATA6、PDGFRA和APOA1（簇3、5和9），我们发现，最近在狨猴中鉴定的继发性卵黄囊（SYS）标志物
随后，我们将人类SEM数据集中细胞的转录谱与整合的人类胚胎参考图谱进行了比较分析
研究人类植入后早期发育对于理解正常人类胚胎发生的基础以及发育性出生缺陷至关重要，因为约三分之一的人类妊娠在着床至妊娠第4周之间失败
在这里，我们重新调整并采用了一种与近期在小鼠中描述的方法相当的策略
人类（以及小鼠）SEM的形成绕过了类囊胚阶段这一事实，以及
原始型多能干细胞的培养条件通常采用FGF/MEK信号抑制，而这会在长期传代后导致印记丢失
检验本文所述的人类SEM是否能够像小鼠SEM那样进一步发育，直至完成原肠形成并启动器官发生，可能具有至关重要的实验意义，并可能为此前无法触及的人类早期发育阶段提供见解
B.O.和E.W.建立了SEM聚合条件及离体子宫外培养方案，设计并完成了大部分湿实验工作，并参与了稿件撰写。B.O.建立了人干细胞培养条件及诱导方案。E.W.和V.B.完成了大部分胚胎免疫染色和共聚焦成像。V.B.进行了光片显微镜分析并协助撰写稿件。B.O.在S.V.协助下构建了细胞系，并优化了最终的SEM方案。A.A.C.进行了部分聚合实验以及该系统的滚瓶培养适配、免疫染色、显微成像和用于10X scRNA-seq实验的样本制备。M.Y.C.协助进行人干细胞培养扩增和优化。C.Z.在F.L.和S.P.指导下，完成了scRNA-seq与既往人类及非人灵长类数据集的比较分析。S.T.参与了谱系诱导条件的优化。R.C.制备了MEF及其他对干细胞维持至关重要的试剂。S.A.和D.L.进行了免疫染色和RT-PCR。F.R.、C.J.和M.R.协助进行了免疫染色。N.L.协助完成慢病毒制备和流式细胞术实验。E.A.负责监督流式细胞术和分选实验。T.S.协助进行了生物信息学分析。S.V.构建了质粒。A.A.C.、M.K.和H.K.S.进行了RNA文库制备和测序。S.A.就光片显微镜实验与分析优化提供了意见。N.N.负责进行并监督生物信息学分析。J.H.H.提出了本项目的构想，并监督数据分析和稿件撰写。
J.H.H.已提交与本文所报告发现相关的专利申请，并担任Renewal Bio Ltd.的首席科学顾问；该公司已获得本文所述技术的许可。
在人与小鼠中，对GATA3、GATA4和GATA6基因进行了ATAC-seq和RNA-seq分析，检测对象包括初始态PSC及多种分化细胞类型（如图所示）。人初始态PSC采用HENSM条件培养。已知增强子以底部灰色条标示。推定增强子以红色或绿色标示：(1) 绿色表示在初始态干细胞中已处于开放状态的潜在增强子；(2) 红色表示在初始态多能干细胞中处于关闭状态、但在至少一种分化细胞状态中开放的增强子。基因近似区域内的推定增强子通过人工筛选确定。与启动子或外显子重叠的开放区域未纳入分析。图中还展示了所示基因在初始态PSC中的RNA-seq结果。后者表明，Gata6、Gata3和Gata4是胚外谱系分化的主调控因子。
引物名称、5’至3’端的DNA序列，以及引用的参考文献（如适用）。
由Seurat软件包鉴定的人SEM中13个细胞簇各自的顶部标志基因（average log2(Fold-change)>0.25）。
该视频展示了构成第8天人类SEM的胚胎及胚外组织结构的三维重建。对上胚层（OCT4，青色）、卵黄囊（SOX17，黄色）、滋养层（CK7，品红色）和细胞核（DAPI，白色）进行了免疫荧光标记。0–8秒，显示SEM形态及外层滋养层的三维视图，其中可见体积增大的多核细胞（亦可见于22秒开始的切片）。8–22秒和39–42秒，显示上胚层（青色）和下胚层（黄色）的三维分割，并以DAPI免疫荧光信号作为背景。22–38秒，对三维体积进行切片，展示SEM的内部结构，包括具有羊膜的双层胚盘、与外层滋养层相连的结构、具有腔隙的卵黄囊，以及周围具有广泛细胞间隙的结缔组织。图中勾勒出了免疫荧光信号和组织分割结果。图像采用Zeiss Z7光片显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
第6天人类SEM的三维重建显示了第6天SEM的三维形态（0–12秒）以及上胚层中央原羊膜腔的早期形成（12–18秒）。对OCT4（上胚层，青色）、F-肌动蛋白（红色）和细胞核（DAPI，白色）进行了免疫荧光标记。图像采用Zeiss LSM 800显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
第8天人类SEM的三维重建显示了胚盘（SOX2，青色）和羊膜（TFAP2C，品红色）。上胚层（青色）和羊膜（粉色）的分割结果以半透明轮廓形式与免疫荧光信号一同显示。17–21秒，人类SEM上胚层呈盘状。图像采用Zeiss Z7光片显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
第6天人类SEM的三维重建显示了卵黄囊的发育（由SOX17，黄色标记）。5–18秒，放大显示脏层和壁层卵黄囊细胞，其细胞形态分别为柱状和鳞状，并具有顶端细胞极性（aPKC，绿色）。F-肌动蛋白（红色），细胞核（DAPI，白色）。图像采用Zeiss LSM 700显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
第8天人类SEM的三维重建显示了位于卵黄囊（黄色）下方并表达VIM（红色）的胚外中胚层细胞。OCT4（上胚层，青色），细胞核（DAPI，灰色）。图像采用Zeiss LSM 700显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
第8天人类SEM的三维重建显示了合体滋养层的发育，其同时表达SDC1（品红色）和HCGB（绿色），并具有多个腔隙。F-肌动蛋白（红色），细胞核（DAPI，灰色）。11–19秒，对三维体积进行切片，显示多个滋养层腔隙的内部结构。图像采用Zeiss LSM 700显微镜获取（见方法部分），并使用Imaris v10.0.0进行处理。
本文所报告的所有涉及人类PSC的实验，均在获得魏茨曼研究所IRB批准（1868-2）后开展，以生成人类
未使用统计学方法预先确定样本量。样本在置于不同生长条件时进行了随机分配。其他实验未进行随机化。由于不存在相关的科学理由，研究人员在实验过程中及结果评估期间未对分配情况实施盲法。
使用了以下已建立的人类ESC系：WIBR3（WT女性）、WIBR2（WT女性）和WIBR1（WT男性）人ES细胞系
人ESC的种子库在经照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上培养，并维持于常规人FGF/KSR始发态条件下。MEF基质上的FGF/KSR条件为：DMEM-F12（Invitrogen 10829），补充20% Knockout Serum Replacement（Invitrogen 10828-028）、1 mM GlutaMAX（Gibco 35050061）、1%非必需氨基酸（BI 01-340-1B）、1%丙酮酸钠（BI 03-042-1B）、1%青霉素-链霉素（BI 03-031-1B）以及8 ng/mL bFGF（Peprotech 100-18B-1MG）。
为将始发态PSC重编程为幼稚态，按照Bayerl等人的方法对人PSC进行维持和扩增
为构建Tet-ON诱导型细胞系，我们采用了PiggyBac质粒，该质粒在多西环素诱导型启动子控制下表达所选cDNA插入片段及转座酶载体（Volker Busskamp惠赠，Addgene质粒#104454）。供体载体携带M2Rtta以及一个用于插入目标转录因子cDNA的位点。我们利用该载体在WIBR3 WT女性人ESC中构建了4种不同的DOX诱导型细胞系：human iCDX2或human iGATA3（用于促进人PSC向滋养外胚层分化），以及human iGATA4或human iGATA6（用于促进人PSC向原始内胚层/胚外中胚层预备化）。进行了约6–8天的嘌呤霉素筛选。挑取抗性克隆并进行培养，以用于后续表征。在DOX（2 µg/ml）诱导目标基因后，通过免疫染色验证插入。已证实转基因表达仅在相应细胞系中加入DOX后才可特异性检测到。这些细胞系的详细构建、表征和验证见（
TSC细胞系分别根据Okae等人和Viukov等人的方法，在幼稚态（HENSM）（nTSC）和始发态条件（pTSC）下建立
人TE细胞来源于人幼稚态PSC；这些细胞先在人HENSM条件下扩增至少3代。在诱导细胞接种前24小时，将其铺板于包被1% Matrigel（corning 356231）的培养板中，并在HENSM中补加10 µM ROCK抑制剂Y27632（Axon 1683）；次日开始实验流程。用于人TE诱导的3天方案此前已有描述，并改编自Io等人的方法
如上所述，Pre/ExEM 细胞由在 HENSM 条件下至少传代扩增 3 代的人类 naïve PSCs 诱导而来。诱导时，于诱导前一天将 HENSM 细胞接种于明胶-MEF 包被板上，并加入 10 µM ROCKi Y27632；次日将培养基更换为 RCL，持续培养 72 h。
本研究最终发表时将附带一份逐步详尽的实验方案。简而言之，为了从人类 naïve PSCs 生成 SEM，使用 AggreWell 24-well plate 400（STEMCELL Technologies 34415）对以下三种起始细胞混合物进行共聚集：
在含 5% CO 的条件下于 HENSM 培养基中培养的 naïve PSC（nPSC）WT 细胞
对于原始内胚层和胚外中胚层组分（PrE/ExEM），将 naïve WT 细胞接种于经辐照的 MEF（小鼠胚胎成纤维细胞条件）/明胶包被板上，在补充有 10 µM ROCKi（Axon Medchem 1683）的 HENSM 中培养。次日，用 PBS 清洗细胞两次（不进行收获），并将 HENSM 更换为 RCL 培养基。在 CO 条件下，RCL 持续培养 72 h，并每 24 h 更换一次培养基。
对于滋养外胚层谱系，将 naïve WT 细胞接种于无饲养层条件（Matrigel）下，并在补充有 10 µM ROCKi 的 HENSM 中培养。次日，用 PBS 清洗细胞两次（不进行收获），并将 HENSM 更换为 BAP 培养基培养 24 h，随后更换为 APJ 再培养 48 h，在 5% CO 条件下进行。
共聚集被定义为该方案的时间点 0。聚集前 12–24 h，所有供体细胞均补充 10 µM ROCKi（Axon Medchem 1683）。在聚集当天（第 0 天），按照制造商说明对 AggreWell 400 24 孔板进行准备。简而言之，每孔加入 500 µl anti-adherence rinsing solution（STEMCELL Technologies 07010），将孔板以 2,000g 离心 5 min，并在室温下孵育 30 min。随后去除清洗液，并用 PBS 清洗孔板。每孔加入 500 µL 聚集培养基，并于 37°C 放置以平衡培养基。聚集培养基（补充 BSA 的 N2B@7 培养基）由以下成分组成：500 ml Neurobasal（Invitrogen 21103-049）与 DMEM/F12（Invitrogen 21331）的 1:1 混合液，5 ml 青霉素-链霉素（Biological Industries 03-033-1B），5 ml GlutaMAX（Invitrogen 35050061），5 ml NEAA（Biological Industries 01-340-1B），5 ml 丙酮酸钠（Biological Industries 03-042-1B），10 ml B27 添加剂（Invitrogen 17504-044），5 ml N2 添加剂（Invitrogen 17502048），1 ml 50 mM β-巯基乙醇（Gibco 31350-010），以及 2.25 ml 35% BSA 溶液（Merck 9048-46-8）。
三种细胞群均使用 TrypLE（Thermo Fisher 12604054）在 37°C 下收集（HENSM 和 RCL 诱导的细胞群处理 3 分钟，BAP(J) 诱导的细胞处理 5 分钟）。随后用真空抽吸去除 TrypLE，并将细胞在室温下孵育 2 分钟，之后使用 PBS 收集细胞。细胞以 1300 rpm 离心 3–5 分钟，并重悬于聚集培养基中。接下来，将 RCL 诱导的细胞铺板于明胶包被的组织培养板上，在 MEF 培养基中于 37°C 下进行 30 分钟的 MEF 去除。MEF 培养基组成为：500 ml DMEM（Gibco 41965-039）、20% FBS（Sigma, F7524-500ml）、5 ml 青霉素-链霉素（Biological Industries 03-033-1B）、5 ml GlutaMAX（Invitrogen 35050061）、5 ml NEAA（Biological Industries 01-340-1B）以及 5 ml 丙酮酸钠（Biological Industries 03-042-1B）。MEF 去除结束后，收集上清并通过 70 µM 细胞滤网，随后将三种细胞类型分别离心、重悬，并在 N2B27 培养基中通过 70 µM 细胞滤网。对三种细胞组分进行计数，并按如下比例在 Aggrewell 400 板中混合：1:1:3（HENSM:RCL:BAPJ）或（Epi:PrE/ExEM:TE）= 每个 24 孔加入 28800 个 Epi（HENSM）细胞、28800 个 PrE/ExEM（RCL）细胞以及 86400 个 TE（BAPJ）细胞。每个单独微孔的细胞数为 120 个。细胞以 2× 浓度并加入 20 µM ROCKi 进行制备，将 500 µl 细胞混合悬液以逐滴方式轻柔加入 AggreWell 板的每个孔中（终体积 1 ml，ROCKi 终浓度 10 µM）。将培养板以 100g 离心 3 分钟，并在低氧条件（5% O
次日（第 1 天），从每孔中轻柔移除 900 µL 培养基，并以 1 ml 预平衡的聚集培养基（N2B27-BSA）进行替换。第 2 天同样更换等体积培养基。在聚集第 3 天，将聚集体轻柔转移至 6 孔细胞悬浮培养板（Greiner, 657185）中，每孔加入 3 ml 预平衡的 EUCM2（20% FBS），并置于轨道摇床上以 60 rpm 转速振荡培养（Thermo Scientific 88881102 + 88881123），摇床位于 5% CO
人源类囊胚按照 Kagawa 等人的方法生成。
小鼠 SEM 聚集按照 Tarazi 等人的方法制备。
适当人类发育的评估通过对现有资料的仔细分析进行。
本文所使用的大多数人类组织学描述和图像均见于 virtual human embryo 网站。
本研究中所纳入的所有人类宫内数据和图像均仅取自 Carnegie 馆藏，并已获得相应的版权批准（审批进行中）。仅将呈现此前定义的全部特征的 SEM 视为发育适当。人类 SEM 的生成百分比基于独立实验中在特定时间点随机视野下观察到的发育适当结构数量进行计算，同时始终依赖免疫荧光来证实三胚层谱系的贡献。
实时 PCR 的统计分析在 QuantStudio 软件 v1.3 中完成，并在 GraphPad Prism 7 中进行可视化。细胞数量和 SEM 效率的可视化及统计分析使用 Python 3.8.5 软件并结合 scipy 和 seaborn 库完成。箱线图表示中位数和四分位距，须线标示分布范围。柱状图显示平均值加标准差。散点表示用于数据分布可视化和分析的各个独立数值。对于非正态分布数据，两组样本间的显著性差异采用双侧 Mann-Whitney 检验进行评估。p
细胞在室温（RT）下于 PBS 中用 4% 多聚甲醛固定 10 min。随后，样品用 PBS 清洗 3 次，在 PBST（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）中通透 10 min，在 PBS/0.05% Tween/5% 胎牛血清/1% 牛血清白蛋白中封闭 1 h，并于 4°C 下用封闭液稀释的一抗孵育过夜。随后，细胞用 PBS/0.05% 清洗（3 次，每次 5 min），并与用封闭液按 1:200 稀释的 Alexa Fluor（488、568 和/或 647）偶联二抗（Jackson ImmunoResearch）孵育。样品随后在室温下用 1 μg/ml DAPI 复染 10 min，用 PBS 清洗 3 次（每次 5 min），并用 Shandon Immuno-Mount（Thermo Scientific）封片。用于细胞免疫荧光的抗体及其稀释度如下：兔多克隆 anti-Cdx2（Cell Signaling，Cat# 3977），1:200；小鼠单克隆 anti-Cdx2（Biogenex，Cat# MU392A-UC），1:200；兔多克隆 anti-Gata4（Abcam，Cat# Ab84593），1:120；兔单克隆 anti-Foxa2（Abcam，Cat# Ab108422），1:100；山羊多克隆 anti-Sox17（R&D，Cat# AF1924），1:200；小鼠单克隆 anti-Oct4（clone C-10）（Santa Cruz，Cat# SC-5279），1:200；兔单克隆 Cdx2（Abcam，Cat# ab76541），1:200；山羊单克隆 Tfap2c（R&D，Cat# AF5059），1:200；兔单克隆 Cytokeratin 7（Abcam，Cat# ab181598），1:200；兔单克隆 Cytokeratin 7（Abcam，Cat# ab68459），1:200；兔单克隆 Nanog（Abcam，Cat# ab109250），1:200；小鼠单克隆 Gata3（Invitrogen，Cat# MA1-028），1:200；山羊多克隆 Gata3（R&D，Cat# AF2605），1:200；小鼠单克隆 HCG-Beta（Abcam，Cat# ab9582），1:200；兔单克隆 Gata6（Cell Signaling，Cat# 5951），1:200；山羊多克隆 Oct3/4（R&D，Cat# AF1759），1:200；山羊多克隆 Gata6（R&D，Cat# AF1700），1:200；兔单克隆 Syndecan1（Abcam，Cat# ab128936），1:500；兔单克隆 PDGFR-A（Abcam，Cat# ab134123），1:100；山羊多克隆 Nidogen2（R&D，Cat# AF3385），1:100。
流式细胞术分析在 BD FACS-Aria III 上进行。细胞用 TrypLE 收集，并用 PBS 清洗一次，随后在 100 ul PBS/0.5% BSA 中加入偶联的一抗（5 ul）孵育半小时。所使用的一抗如下：小鼠单克隆 TROP2-488 标记抗体（R&D，Cat# FAB650G）；小鼠单克隆 TROP2-PE 标记抗体（R&D，Cat# FAB60P）；小鼠单克隆 CD249（ENPEP）-BV421 标记抗体（BD，Cat# 744872）；大鼠单克隆抗小鼠 CD140a（PDFGR-a）-PE/Cy7 标记抗体（BioLegend，Cat# 135912）；小鼠单克隆抗人 CD140a（PDFGR-a）-PE/Cy7 标记抗体（BioLegend，Cat# 323508）；小鼠单克隆抗人 CD140a（PDFGR-a）-APC 标记抗体（BioLegend，Cat# 323512）。采用 FSC 和 SSC 对单细胞进行门控，且所有分析仅纳入单个细胞。采用未染色对照来确定所有抗体的阴性/阳性群体，确保未染色群体的 100% 被划分到直方图/点图的阴性区域。
免疫荧光图像使用 Zeiss LSM 700 以及 LSM 800 倒置共聚焦显微镜（Zeiss）采集，两者均配备 405 nm、488 nm、555 nm 和 635 nm 固态激光器，并使用 Plan-Apochromat 20× 空气物镜（数值孔径 0.8）或 EC Plan Neofluar 10× 空气物镜（数值孔径 0.3）。有关成像参数的详细说明，见
免疫荧光图像使用 Zeiss Z7 光片显微镜采集，该设备配备 405 nm、488 nm、561 nm 和 638 nm 激光器，使用单个水浸 20× Plan-Apochromat 检测物镜（数值孔径 1.0，Zeiss）以及两个空气 10× Plan-Apochromat 照明物镜（数值孔径 0.2，Zeiss）。每次对单一样本进行成像，样本包埋于成像腔室内 PBS 中的 1% 低熔点琼脂糖中。沿 Z 轴的光片体积数据以双扫描模式采集，并采用枢轴扫描。光片厚度设定为 3.77 µm，激光功率设定在 1–50% 范围内。帧大小为 1920×1920 px，曝光时间为 50 ms。针对每个通道，左侧和右侧照明的光片均根据检测透镜焦平面中的信号强度，在样本体积内独立调节。另见
第 6 天后，人类 SEM 可继续保存在子宫外电子控制滚轴培养平台中
按照生产商说明，使用 RNeasy mini kit（Qiagen）分离总 RNA。随后，取 1 μg 总 RNA，使用 High-Capacity Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）进行反转录。RT-PCR 采用 SYBR Green PCR Master Mix（Qiagen）进行三重复检测，并在 Viia7 平台（Applied Biosystems）上运行。所有实验中的数值均以 Actin 和/或 Gapdh 进行标准化。数据表示为相对于参考样本的倍数差异，参考样本设定为 1。所使用的 RT-PCR 引物列表见
在子宫外培养条件下生长的人类 SEM 经手工挑选并收集，用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）
10x Genomics 数据分析采用 Cell Ranger 7.1.0 软件（10x Genomics）对原始测序数据进行预处理，并使用 Seurat 4.3.0 进行下游分析。为去除低表达的单细胞、10x 样本处理过程中可能产生的双细胞，以及线粒体表达比例过高的单细胞，我们过滤掉了表达基因数少于 1000 个、表达基因数超过 8,000 个以及线粒体基因表达比例超过 15% 的细胞。随后，对所有单个样本进行 Seurat 整合分析与锚定，并采用尺度因子为 10,000 的对数归一化方法进行标准化。通过方差稳定转换方法识别出前 2,000 个高变基因，并进一步进行缩放和中心化处理。采用主成分分析对维度进行评估，并使用“elbow”方法确定主成分数。前 10 个维度显示了数据变异性的主要部分。因此，在所有样本中基于前 10 个维度进行 UMAP 降维。使用 Seurat 的 Find Clusters 函数检测聚类，分辨率参数设为 0.5。使用 Seurat DotPlot() 函数生成描述特定基因表达及其普遍性的点图。利用 Seurat FeaturePlot() 函数生成所选基因在 SEM UMAP 上的投影图。
人类胚胎参考图谱通过整合先前发表的数据集构建，这些数据集包括 5 个人类胚胎数据集，涵盖体外培养的人类囊胚。
选取 Rhox5 阳性细胞（>1 counts）用于胚外组织分析。细胞依据标志基因进行注释，与此前在……中所采用的方法一致。
所选基因（GATA3、GATA4、GATA6）邻近区域的 bulk ATAC-seq 和 RNA-seq 图谱使用 IGV 基因组浏览器展示。小鼠数据集取自已发表的数据集。
所有 scRNA-seq 数据已提交至 GEO：XXXXXXXXX。
重新分析本研究所报道数据所需的任何其他信息，可根据请求向通讯作者获取。
J.H.H 实验室的经费来源包括 Pascal and Ilana Mantoux；Flight Attendant Medical Research Institute（FAMRI）；MBZUAI-WIS Program、ISF；Minerva、Israel Cancer Research Fund（ICRF）、Kimmel Stem Cell Research Center，以及 Renewal Bio Ltd. 资助的研究项目。F.L. 实验室获得 Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine、Ragnar Söderbergs Stiftelse、Wallenberg Academy Fellow、Center for Innovative Medicine 以及 Karolinska Institutet SFO Stem Cells and Regenerative Medicine 的支持。S.P. 实验室获得 Swedish Research Council 和 Swedish Society for Medical Research 的支持。S.P. 担任 Canada Research Chair in Functional Genomics of Reproduction and Development（950-233204）。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.14.544922
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