- 4 次围观
人类胚胎的植入开启了一个关键的发育阶段，其中包括胚胎及胚外组织的深刻形态发生变化、体轴形成以及原肠胚形成事件。由于难以获得相关样本，我们对这一人类生命阶段的机制性认识仍然有限。
解析人类胚胎发生的机制具有巨大的生物医学意义，涵盖从治疗先天性疾病和不孕不育，到构建功能性人类器官等多个方面。植入后，胚胎及其共同发育的胚外组织经历显著重塑，并启动对妊娠成功至关重要的形态学变化，包括羊膜腔的形成以及卵黄囊造血的出现。
在此，我们提出了一种来源于人类干细胞的胚胎模型，称为“
我们构建了一株带有可诱导基因回路的人诱导多能干细胞（hiPSC）细胞系，该细胞系可表达人GATA6——一种决定胚外内胚层命运的关键转录因子（以下称为iGATA6）(
（A）示意图展示了在多西环素（Dox）诱导GATA6后，iGATA6（绿色）与WT（强橙色）hiPSC的细胞混合及其后续组织化过程。
（B）免疫荧光染色显示培养体系中iDiscoid的自组织过程。比例尺 = 1000 µm
（C）一枚iDiscoid的活细胞延时成像图像，显示中心腔由箭头所示的玫瑰花结结构生长形成。比例尺 = 50 µm。
（D）活体培养第4天的iDiscoid培养物的明场与荧光图像，显示已形成的iDiscoid形态，其中表达EGFP的iGATA6包围WT细胞团。比例尺 = 100 µm
（E）对具有不同iGATA6覆盖程度及腔形成特征的WT细胞团特征进行定量分析。未观察到未被覆盖的细胞团具有腔结构（-/+ = 0%）
（F）单细胞UMAP以及对第2天iDiscoid与人类和非人灵长类（NHP）胚胎单细胞数据集之间差异表达基因（DEG）列表进行的超几何统计比较。热图上方的标签表示植入前与植入后胚胎样本的比较；标签下方的灰色条表示NHP比较。
（G）单细胞UMAP以及对第4天iDiscoid与人类和NHP胚胎单细胞数据集之间差异表达基因（DEG）列表进行的超几何统计比较。黑色方框标示出与相关目标细胞群具有较高DEG相似性的区域（高P值）。
为应对这些挑战，我们旨在开发一种替代策略，通过激发hiPSC从二维到三维的自组织过程，在培养板表面生成结构。将iGATA6-hiPSC与WT hiPSC混合后，按照预定比例和细胞密度将混合细胞群接种于标准培养板上（
我们观察到，在未被iGATA6层包围的WT细胞团中，未见腔形成（
在初步分析中，我们观察到，对于第5天面积较大且通常圆形度较低的WT细胞团，腔形成是通过多个腔的方式发生的。
为探究所形成细胞群体的细胞身份，我们对 iDiscoid 培养体系第 0 天至第 5 天进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。
早在诱导后 24 小时（D1），iDiscoids 中即出现了若干细胞群体（D1_G1、G2、G3），其转录组与人类下胚层表现出相似性，同时还存在相应的类上胚层细胞群体（D1_W1）。
在第 2 天，iGATA6 群体内观察到与卵黄囊内胚层具有显著统计学相似性的细胞群（簇 D2_G1、D2_G2、D2_G3、D2_G4；p = 1.3×10）。
在 WT 簇内，通过缺乏
当我们整合不同天数的所有细胞簇时，iGATA6 和 WT 谱系在投影空间中占据了彼此不同的区室。然而，我们确实观察到与其采样时间相一致的人群空间定位。
灵长类羊膜发生在结构和时间上均不同于小鼠中的过程，这凸显了对人类模型系统的需求，以为理解人类特异性发育动态提供窗口。
(A) 按发育天数标注的 iDiscoid 中所有 WT 谱系的合并 UMAP 图。
(B) 合并后的 WT 群体显示出表达羊膜标志物的区室。
(C) 单个 iDiscoid 的正交切面显示 ISL1+（青色）与 NANOG+（红色）细胞在上下方向上的区室化分布，而 iGATA6 细胞覆盖顶部（白色）。
(D) 图（C）中 WT 簇在距培养皿所示距离处的水平 z 轴切片。
(E) 示意图显示单个 iDiscoid 内各细胞群体的位置。虚线表示所示切片的区域。
(F) iDiscoid 中 BMP4 效应分子（磷酸化 SMAD1、SMAD5 以及 SMAD8/9）的表达模式。下方图像显示所示 WT 盘状结构的侧向切面。
(G) 在发育第 2 天加入抑制剂 Noggin 后，于第 4 天对 iDiscoid 进行 BMP4 效应分子（磷酸化 SMAD1、SMAD5 以及 SMAD8/9）免疫荧光染色。下方图像显示所示 WT 盘状结构的侧向切面。
(H) 在发育第 2 天加入 Noggin 后，于第 4 天对 iDiscoid 进行 ISL1 和 NANOG 的免疫荧光染色。下方图像显示所示 WT 盘状结构的侧向切面。
(I) 散点图显示 WT 簇内 ISL1 表达（D4）强度；比较对照（Ctrl）iDiscoid 与 BMP4 抑制（Noggin）条件。n[control] = 87，n[Noggin] = 134，**** p
比例尺 = 100 μm。n 表示来自单次实验、于相应日期采集的独立生物学样本。
进一步对 pSMAD1、pSMAD5 和 pSMAD8/9（BMP4 效应分子）进行免疫荧光染色，结果显示 iDiscoid 中 BMP4 信号转导呈环状分布，并集中于 iDiscoid 的边缘（
综上，我们得出结论：iDiscoids 表现出稳健的羊膜发生，并形成依赖于 BMP4 信号传导的背腹（D-V）轴，这支持 iDiscoids 作为研究人类这一关键发育事件模型系统的应用价值。
(A) 所有 iGATA6 谱系合并后的 UMAP，显示表达前部下胚层标志物的区室。观察到这些标志物存在两个独立区域，一个位于第 2 天 iDiscoid 细胞内，另一个位于第 3–5 天 iDiscoid 细胞内。（按天数标注的 UMAP 见补充图 5）
(B) 所有 WT 谱系合并后的 UMAP，显示表达后轴和原条标志物的区室。
(C) 免疫荧光染色显示一个 iDiscoid 的 z 切片，其中可见与 WT 簇相邻的 HHEX/LHX1/CER1 三重共阳性区域。虚线表示各图像中 WT 簇的边界，箭头表示共阳性区域。
(D) 免疫荧光染色显示 iDiscoid 中 WT 簇内部的 TBXT/MIXL1 双重共阳性区域。
(E) WT 簇的示例：具有极化的 TBXT/MIXL1 区域（上）或不具有标志物共表达（下）。维恩图显示了在 iDiscoid 培养中观察到的各类簇所占比例，总 n = 746。
(F) 维恩图显示当 CER1 局限于一极时，具有特定 TBXT/CER1 极性类型的簇所占比例。总 n = 169。
(G) 代表性 WT 簇显示簇两极相对的 TBXT 和 CER1 表达区域（反极性，顶部），或位于簇同一极的表达区域（同极性，底部）。
(H) 示意图显示了 (F) 中所示具有极化 CER1 表达区域的 WT 簇中，不同极性模式下 TBXT 的平均径向表达模式。所有示意图均按相同表达强度值（1 a.u.）进行缩放。角度表示沿圆形化 WT 簇周边、相对于所示 CER1 峰值的径向距离。阴影区域表示与极性类型对应的平均 TBXT 极性最高区域。
比例尺 = 100 µm。n 表示来自 3–4 次独立实验、在 iDiscoid 诱导后第 4 天收获的独立生物学样本。
免疫染色鉴定出一部分围绕 WT 簇的胚外细胞中表达前部下胚层相关蛋白（CER1、LHX1、HHEX）的细胞区域（
随后，我们分析了 iDiscoid 培养物以评估前后轴定位情况。在第 4 天，我们观察到，在 CER1 表达细胞呈极性构型的 iDiscoid 中，60.4±5.3%（169 个中的 102 个）具有一个 TBXT 表达极（
接下来，我们旨在确定，在 iDiscoid 中观察到的邻近后部区域或位于后部区域内部的 CER1 表达，是否能够在……期间被识别
总之，我们对 iDiscoid 的分析，结合对现有……的探索，
卵黄囊是一种多功能胚外组织，在为胚胎提供营养支持的同时，也作为早期造血的枢纽；人类发育约 E16–18 时开始出现早期血液生成，并在此后逐渐成熟。
(A) 热图显示第 5 天 iDiscoid 的 scRNA-seq 细胞群与人类 E16–19 胚胎中的造血细胞群的比较。
(B) 点图显示第 5 天 iDiscoid 的 scRNA-seq 细胞群中造血标志物的表达模式。
(C) 免疫荧光图像显示了 iDiscoid 培养中表达 CD34 和 TAL1（scl）的细胞分布。表达 TAL1 的细胞定位于卵黄囊内胚层区室与组织培养皿之间，并形成梭形细胞排列。正交切片显示了梭形细胞贴附于培养皿的位置。虚线表示获取该切片的位置。
(D) 第 12 天拍摄的活体相差图像显示了在 iDiscoid 组织内产生的球形细胞。虚线框表示插图区域。
(E) 第 12 天 iDiscoid 的免疫荧光图像显示，CD31+ 内皮细胞内生成了 CD43+ 球形细胞。
(F) 第 12 天 iDiscoid 的免疫荧光图像，其中以 25% 的 GATA6 高表达细胞替代了正常 iDiscoid 比例中的相应细胞。
(G) 直方图显示了在以给定比例替代 GATA6 高表达细胞的实验中检测到的 CD43+ 细胞数量。n[0%] = 4 个实验重复，n[10%] = 2 个实验重复，n[25%] = 2 个实验重复。
(H) 来自单个类血岛结构的两张切片显示，Desmin+ 中胚层细胞和 CD34+ 内皮细胞定位于 FOXA2+ 内胚层下方。
(I) 直方图显示了所示标志物在培养皿底部与培养物顶部之间沿 z 轴的分布。FOXA2 的双峰分布表明其在类血岛灶之外的区域也存在表达。该分布为来自 3 个技术重复中 9 个灶的平均值。
(J) 一个血岛区域的三维重建图像显示了内胚层（FOXA2）、内皮（CD34）和中胚层（Desmin）标志物的空间定位。
(K) 示意图描绘了体内胚胎卵黄囊血岛以及体外 iDiscoid 卵黄囊类血岛结构。
在第 5 天 iDiscoid 中观察到早期造血潜能后，我们将 iDiscoid 培养延长至第 5 天之后，以更好地考察该系统的造血潜能。我们观察到，当培养在 mTeSR 条件下维持时，CD34+ 区域仅发生了极小程度的扩增。
对第 12 天观察到的细胞类型进一步研究表明，存在带有卵黄囊来源髓系谱系标志的细胞，包括巨噬细胞（CD33
本文所述的 iDiscoid 同时发育出胚内和胚外谱系，并呈现出若干此前首次在一种
从工程学角度看，iDiscoid 平台凸显了组织生态位工程和共分化在促进形态发生事件方面的强大能力。
本研究经匹兹堡大学人类干细胞研究监督委员会批准并在其监督下开展。本研究所报告的工作遵循了 2016 年《干细胞研究与临床转化指南》以及 2021 年 ISSCR《干细胞胚胎模型伦理标准指南》。
所有细胞和组织均在 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养。
先前构建的表达 rtTA 的 PGP1 hiPSC。
将经 GATA6 工程化的 hiPSCs 与表达 rtTA 的 PGP1 hiPSCs 按 81:5 的比例接种，后者可含有或不含有 mKate 报告基因，总接种密度为每平方厘米 54,000 个细胞。
未诱导的 iDiscoid 细胞在汇合度达到 70% 时，用 Dispase 处理 10 分钟，或处理至可见菌落边缘翘起。随后用 DMEM/F-12 清洗细胞两次，再以手工方式将菌落从培养板上刮下。菌落以 300g 离心 5 分钟，随后重悬于 Cryostor 10 中。细胞先于 −80°C 条件下冷却 24 小时，再转移至液氮中进行长期保存。细胞在复苏前于液氮中至少保存 24 小时。
在 iDiscoid 培养第 2 天，通过向常规培养基中加入 100 ng/ml Noggin 抑制 BMP4 信号通路。在后续各天更换的培养基中均补加该浓度的 Noggin。
细胞培养于铺有 Matrigel 的直径 8 mm 圆形玻璃盖玻片、14 mm 玻片底培养皿（Mattek Corporation）或 8 孔 µ-Slide（ibidi）上。培养物在室温下用 4% 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences）固定 10 分钟。随后将盖玻片用 PBS 清洗 3 次，并以 PBS 中含 0.2% Triton X-100 的通透液处理 15 分钟。之后，盖玻片在洗涤缓冲液（PBS 中含 0.05% Tween-20）中每次 5 分钟清洗 3 次，并在 200 ml 洗涤缓冲液加 5% 正常驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories）中封闭 20 分钟。将一抗稀释于 PBS 中含 5% 正常驴血清的溶液中，于室温下与组织孵育 1 小时，随后在洗涤缓冲液中每次 5 分钟清洗 3 次。将二抗稀释于 PBS 中含 5% 正常驴血清的溶液中，于室温下与组织孵育 1 小时，随后在洗涤缓冲液中每次 5 分钟清洗 3 次。之后，将 8 mm 盖玻片使用 ProLong Glass Antifade（Life Technologies）封片于显微镜载玻片上，在室温下固化过夜，并以指甲油封固。位于玻片底培养皿或 µ-Slide 中的盖玻片置于 4°C 的 PBS 中保存，以用于三维成像。
图像使用 EVOS M700 自动扫描显微镜、Leica SP8 共聚焦显微镜、Sartorius Incucyte 活细胞成像系统或 Nikon A1 共聚焦显微镜采集，并使用 Fiji/ImageJ 软件（NIH）进行处理。
拼接获得的整张盖玻片图像被裁剪为中央内接正方形区域（通常为 9000 μm）。
通过从分区边界向各分区质心方向绘制一条预定义距离的线，并记录该范围内每个点处各标记物的强度值，对从分区周边向内的标记物表达进行了分析。若所绘制的线会与分区边缘相交（例如从凹形结构的外缘进行绘制时），则跳过这些数值。对每条线记录的强度值取平均，以生成最终的每分区表达分布。在存在CER1表达峰值时，这些分布基于CER1最大表达点进行对齐，并使用MATLAB中的imresize函数将各分布长度统一为所记录的最长边界长度。
WT簇的覆盖情况通过拍摄整个盖玻片的宽场图像进行评估。在WT簇内部观察到EGFP表达且其面积大于该簇面积50%的区域被计为已覆盖。腔隙/空腔的存在与否通过人工评估，并依据野生型分区内是否存在可见的PODXL、ZO-1或F-actin表达环来判定。
WT圆盘内的ISL1表达通过对上述方案获得的径向表达值取平均进行记录。
围绕WT分区的TBXT和CER1结构域极性按如下方式评估：首先，将径向簇分析得到的CER1和TBXT原始值通过除以各点测得的F-actin强度，按细胞密度进行归一化。随后，对于每个圆盘周围记录的每一个点，计算距该点沿圆盘周向任一方向各1/8圆盘半径范围内所有点的CER1和TBXT值的平均值。标记物阳性通过比较滚动平均值的最小值和最大值来判定；若其差值大于0.1归一化强度单位（a.u.），则认为该标记物为阳性。对于阳性岛，比较CER1最高平均象限值的径向角度索引与TBXT最高平均象限值的径向角度索引：若WT分区中TBXT的平均峰值位于距CER1峰值135°至225°之间，则认为其为反极性；若TBXT峰值位于CER1峰值45°范围内，则认为其为同极性。每个岛的极性类型归类均通过人工目视加以验证。
每种标记物的整个盖玻片免疫荧光图像先裁剪为正方形，然后划分为等面积象限以便于分析。WT簇掩膜通过在Fiji/ImageJ中进行手动阈值分割并创建二值图像生成。随后，利用这些二值图像，并通过对各单独通道图像应用Image Calculator功能，将WT簇从图像中去除。所得图像随后使用CellProfiler中的自定义流程进行分析。
在每个已识别区域的近中心位置采集共聚焦 z 轴堆栈图像。对于每个堆栈，底部被定义为能够识别到清晰聚焦标记物的最低 z 轴索引。将底部索引以上每个切片内所有像素的像素强度值求和后，再除以像素数。随后，对所有已识别样本中各对应 z 轴索引处所得数值取平均；再将这些数值转换为相对于最大值的百分比，以生成所示图表。
使用商业化 ELISA 试剂盒（abcam）对样本中的 AFP 和 APOA1 进行检测。对样本稀释倍数进行了优化，以确保各项检测均处于各自标准曲线的线性检测范围内。
对于细胞活率 >80% 的样本，按照 10x Genomics 单细胞 RNA 测序细胞多重寡核苷酸标记方案中的 Cell Multiplexing Oligo Labeling Protocols 所述方法制备样本。将各所示日期的 iDiscoids 于 37°C 下用 Accutase 孵育 20 分钟，以获得单细胞悬液。细胞悬液经 40 μm 滤网过滤以去除细胞聚集体。随后，每份样本悬液在室温下以 300g 离心 5 分钟。使用 P1000 移液器手动吸除各样本上清。将每个细胞沉淀重悬于 1 ml PBS + 0.04% BSA 中，并在室温下以 300g 离心 5 分钟。随后将样本重悬，目标浓度为 1×10
随后，样本在室温下以 300g 再次离心 5 分钟。使用 P1000 移液器手动吸除上清。将样本重悬于 50 μl CellPlex Multiplexing Solution（10x Genomics）中，并为每个样本分配唯一的多重寡核苷酸溶液。最多可同时对 12 份样本进行标记。自最后一份样本加入寡核苷酸溶液后开始计时，样本孵育 5 分钟。
标记后，向每份样本中加入 1.95 ml 1× PBS + 1% BSA，并充分混匀。每份样本在 4°C 下以 300g 离心 5 分钟。使用 P1000 移液器手动吸除上清，并尽可能使每份样本中残留上清少于 10 μl。将样本重悬于 2 ml 1× PBS + 1% BSA 中并充分混匀以进行清洗。该清洗及离心步骤另外重复两次；最后一次重悬时，加入足量清洗缓冲液，使细胞计数达到 1×10
在最终计数和活性分析完成后，将细胞和 10x Genomics 试剂加载至单细胞芯片中，以 25,000 个单细胞作为分析目标，同时考虑到《Chromium Single-Cell 3’ Reagent Kit（10x Genomics）》用户指南中所述的、由多重化导致的预期细胞损失和双细胞事件。在生成 GEMs 后，Pitt Single Cell Core 的工作人员按照 10x Genomics 用户指南中规定的相应步骤制备 cDNA 文库。文库随后送至 UPMC Genome Center，使用 NovaSeq S4-200 进行测序，目标测序深度为每个细胞 100,000 条 reads，采用 150 bp 双端测序。我们对测序数据进行下游分析后发现，不同样本中每个细胞的平均 reads 数介于 40k–150k 之间。
采用 10x Genomics CellRanger 流程将 reads 比对至附加了转基因序列的参考基因组（GRCh38.84），将 reads 分配至单个细胞，并基于 UMI 计数估算基因表达量。
基于线粒体基因组转录本比例较高，以及 feature 数或 UMI 计数过高或过低的标准，排除了部分单细胞数据。UMI 计数出现在少于 5 个细胞中的基因被移除，不纳入后续分析。对于使用 Seurat 进行的 scRNA-Seq 数据处理和聚类分析
我们采用用于过度富集分析的超几何检验来量化两组标记基因列表 A 和 B 之间的相似性。这等价于单尾 Fisher 确切检验。
用于计算图中柱状图 p 值的统计检验为
细胞使用 accutase（StemCell Technologies）消化为单细胞悬液。CD34
集落形成单位实验的输入和输出细胞均通过流式细胞术进行免疫表型分析。细胞与人源抗 CD235a、抗 CD71、抗 CD45、抗 CD11b 和抗 CD34 抗体（BioLegend）在冰上孵育 30 分钟进行染色。随后使用 LSR II 流式细胞仪（BD Biosciences）对细胞进行分析，并采用 7-AAD（ThermoFisher Scientific）作为死细胞染料。数据分析使用 FlowJo 软件完成。门控策略示例见补充图 21。
为制备样本，在 6 孔板中的 4–6 个孔内培养 iDiscoids，并在进行 CD34 之前将样本合并。
本研究期间产生和/或分析的数据集可在合理请求下向通讯作者获取。
J.H.和M.R.E.构思了本研究；M.R.E.、Z.B.J.、B.S.和S.K.监督了该项目；J.H.、M.R.E.、S.K.、A.A.、K.K.F.、J.V.、R.L.、D.S.和Z.B.J.构思了实验方法学；J.H.、R.S.、K.K.F.、J.V.、R.L.、M.N.T.和M.R.进行了iDiscoid实验；J.H.、R.S.、K.K.F.、T.M.、M.N.T.、S.W.和D.S.进行了成像与分析；J.H.、A.A.和Q.S.进行了scRNA-seq数据集的生物信息学分析；R.L.和K.K.F.进行了流式细胞术及分析；J.H.、A.A.、K.K.F.、J.V.、R.L.、D.S.和M.R.E.进行了数据可视化；M.R.E.、S.K.、Z.B.J.和J.H.为该项目获取了经费；J.H.和M.R.E.撰写了论文初稿；J.H.、R.S.、K.K.F.、M.R.E.、B.S.、S.M.C.S.L.、A.A.、J.V.、S.K.和Z.B.J.参与了论文终稿的编辑并提供了意见。
J.H.、S.K.和M.R.E.已就此处所展示的技术提交了知识产权申请。
（A）用于构建可诱导表达GATA6的iPSC的基因回路。pConst为组成型活性启动子。
（B）通过流式细胞术分析检测到的iGATA6细胞中EGFP（GATA6）激活的异质性。更高的基因回路拷贝数会导致更高水平的EGFP和GATA6表达。
（C）iGATA4与WT的3D培养显示，羊膜标志物ISL1与多能性标志物NANOG在WT层中广泛共表达，且未出现背腹轴极化。中间切片显示中央腔的形成。
（D）iGATA4与WT的3D培养显示，多能性标志物NANOG在整个WT层中表达，但这些3D组织中有相当一部分缺乏ISL1表达。这些球体同样未表现出极化。
（E）示意图显示了3D条件下以及由2D>>3D形成的iDiscoid发育过程，并与胚胎形态进行了比较。iDiscoid类似于一个扁平化的卵黄囊腔，具有上胚层界面和羊膜腔。
（A）固定培养物的免疫荧光图像显示了GATA6诱导后第0天至第3天期间iGATA6（绿色）和WT（NANOG）hiPSC的细胞组织情况。随着iGATA6细胞获得更类似卵黄囊内胚层的形态，PDGFRα在这些细胞中升高。
（B）GATA6诱导后第0天至第3天，iGATA6/WT共培养中单一位置的延时成像图像。上方裁剪图像对应于下方图像中白框所示的位置。比例尺 = 200 μm。
（C）延时成像图像显示，在iDiscoid诱导后D2之前，红色WT细胞最初被绿色iGATA6细胞限制，随后iGATA6细胞迁移覆盖WT盘面。
（D）两个代表性iDiscoid的Z轴切片显示了OCT4、GATA4和SOX17在iDiscoid培养中双层盘状区域内的定位，以及至第5天中央腔的形成。
(A) 免疫荧光图像显示了诱导后 iDiscoid 发育第 1、3 和 5 天 LAMA1 沉积的动态变化。虚线框标示了第 3 天和第 5 天图像中第四个面板插图所对应的区域。
(B) 时间过程图显示了在 iDiscoid 发育前 5 天中，免疫荧光图像内 LAMA1 信号的增强。散点表示在单次实验中于每天收集样本后随机选取的区域。
(C) 免疫荧光图像显示，在具有中央腔的 WT 簇周围存在层粘连蛋白沉积，同时 PODXL 发生极化。
(D) 免疫荧光图像显示了一个代表性 WT 簇的水平切片和侧向切片，其中 PODXL 和 ZO-1 朝向中央腔发生极化。
(E) 第 3 天 WT iPSC 的一个代表性细胞簇。在该细胞簇周围未观察到层粘连蛋白沉积。
(F) ELISA 比较了在 Dox 诱导 GATA6 后第 0 天（D0）和第 5 天（D5）检测到的分泌型 AFP 和 APOA1。单个散点表示生物学重复。
(A) 在具有 iGATA6 覆盖的 iDiscoid 中，WT 簇面积相对于所观察到腔数量的分布。阴影区域表示 Hertig and Rock，1949 以及 Heuser 等，1945 记录的 E9 至 E17 双胚层胚盘面积范围；观察到的胚盘中有 64% 的面积落在该范围内，39.8% 具有单一腔结构。33.2% 同时符合这两个类别。总 n = 331。
(B) 在具有 iGATA6 覆盖的 iDiscoid 中，WT 簇圆形度相对于所观察到腔数量的分布，并附有一个具有所示特征的 iDiscoid 代表性图像。N = 331，比例尺 = 100 μm。
(C) 热图显示了由不同初始接种密度的 iGATA6 和 WT 产生的 iDiscoid 的平均面积。虚线框标示了用于 iDiscoid 实验的优化接种密度。
(D) 热图显示了由不同初始接种密度的 iGATA6 和 WT 产生的 iDiscoid 的平均圆形度以及每 mm2 的平均胚盘数量。虚线框标示了用于 iDiscoid 实验的优化接种密度。
(E) 按照 C 中所示优化比例接种时，在具有 iGATA6 覆盖的 iDiscoid 中，WT 簇面积相对于所观察到腔数量的分布。阴影区域表示 Hertig and Rock，1949 以及 Heuser 等，1945 记录的 E9 至 E16–19 双胚层胚盘面积范围；有 74% 的胚盘落在该面积范围内。89.7% 的胚盘具有单一腔结构。70.9% 的胚盘同时符合这两个类别。总 n = 79。
(A) iDiscoid 发育过程中截至第 5 天各时间点的单独 UMAP 投影及聚类结果。
(B) 小提琴图显示了 iDiscoid 第 0、2 和 4 天各簇中的一组人工筛选基因。iDiscoid 各簇按 GATA6 表达水平由低到高排序。“W”簇为推定野生型谱系的细胞簇；“G”簇为推定 iGATA6 谱系的细胞簇。
（A）将每个 iDiscoid 天数与 Tyser 等人（2022）注释的人类胚胎细胞群进行超几何统计比较。每列上方的蓝点表示该天数中所示各细胞群的相对 GATA6 表达水平。
（B）将每个 iDiscoid 天数与 Xiang 等人（2020）注释的人类胚胎细胞群进行超几何统计比较。所使用的尺度与 A 图相同。
（C）将每个 iDiscoid 天数与 Ma 等人（2019）注释的食蟹猴胚胎细胞群进行超几何统计比较。所使用的尺度与 A 图相同。
iDiscoid 簇对应于扩展数据图 5 中按天分别聚类得到的簇，并按 GATA6 表达水平从低到高沿 x 轴自左向右排列。“W”簇为推定野生型谱系的簇；“G”簇为推定 iGATA6 谱系的簇。虚线轮廓表示每个簇中最值得关注的命运比较。
其他数据集中的缩写：NNE = 非神经外胚层，DE（P）= 确定性内胚层（增殖型），DE（NP）= 确定性内胚层（非增殖型），YS = 卵黄囊，PGC = 原始生殖细胞，CTB = 细胞滋养层，STB = 合体滋养层，EVT = 绒毛外滋养层，PSA-EPI = 上胚层中的原条始基，EXMC = 胚外中胚层细胞，E- = 早期，L- = 晚期，Gast = 原肠胚形成细胞，AM = 羊膜，VE/YE = 内脏内胚层/卵黄囊内胚层
（A）显示按天注释的合并 iDiscoid 簇的 UMAP 图。
（B）显示应用无监督聚类后的合并 iDiscoid 簇的 UMAP 图。
（C）显示合并的第 0 天至第 5 天数据集中各簇对应前 20 个基因的热图。
（A）第 4 天羊膜标志物 ISL1 和 AP-2α 的免疫荧光染色。展平盖玻片的俯视宽场图像。比例尺 = 100 μm
（B）第 4 天 iDiscoid 单细胞 RNA 测序中 BMP 通路标志基因的点图。BMP4 表达及若干相关基因（红框标出）在类羊膜细胞群中最高。
（A）对照 iDiscoid 显示出 TBXT+ 后部结构域和表达 CER1 的 LHX1+ 区域的发育。
（B）在第 2 天加入 100 ng/mL Noggin 的 iDiscoid 显示存在表达 CER1 的 LHX1+ 区域，但不表达 TBXT+ 结构域。在 WT 圆盘周边的 iGATA6 谱系细胞中可见 TBXT 表达。
（A）一个具有代表性的 WT 簇显示，TBXT 和 CER1 分别在 WT 簇和 iGATA6 层内呈现 syn-极性。实心箭头表示 iGATA6 层内表达 CER1 的细胞；空心箭头表示 WT 层内共表达 CER1 和 TBXT 的细胞。Z 切片为来自两个不同 WT 圆盘中心区域的代表性切片。
(B) 代表性WT簇显示，在WT簇和iGATA6层内分别存在TBXT与CER1的反极性分布。实心箭头表示位于iGATA6层内的CER1表达细胞；空心箭头表示位于WT层内的CER1与TBXT共表达细胞。Z切片为取自WT圆盘中心的代表性切片。
(C) 上图显示了所有D0–D5 scRNA-seq数据合并后的UMAP，显示表达抑制因子CER1的后部区室。虚线框标示WT谱系。后部区域示意于
(A) Bergmann等人（2022）报道的CS5和CS6狨猴胚胎中TBXT与CER1的空间表达。在狨猴CS5阶段，CER1在覆盖胚盘的胚外内胚层中呈高水平且无极性表达；到CS6阶段，其总体表达下降，并观察到极轻微的、远离推定后部的极化。自CS5至CS6，TBXT在胚盘内由无区域化/双极表达转变为在胚盘一极的强表达。
(B) Tyser等人（2022）报道的人类E16–19（CS7）胚胎中TBXT与CER1的区域表达。TBXT和CER1的最高表达可见于胚胎尾侧部分，该区域对应于原条所在区域及覆盖其上的下胚层，如示意图所示。
(C) Cui等人（2022）报道的食蟹猴E18–E20胚胎中TBXT与CER1表达的伪空间表示。右侧示意图显示了经显微解剖的胚胎切片，并标注了与各鉴定组织层对应的标签。CER1表达在下部胚胎区（EM-Low）和中部胚胎区（EM-Mid）区域层中与TBXT表达高度重叠。
(D) 小鼠E6.5–E8.5胚胎中T和Cer1的表达水平。在原条前部区域内存在显著的共表达。
(E) 来自153个覆盖E6.5–E7.5阶段小鼠胚胎的前部原条元细胞中T和Cer1的表达水平。在这一代表性细胞/细胞类型中，T和Cer1随时间在原条前部共同升高。
(F) 约E6.5–E7.5小鼠胚胎中T和Cer1的空间表达水平。这些标记在后部区域前端附近的区域中共表达。示意图中的方框区域对应并突出显示了这一范围。右侧示意图显示了左侧示意图Y轴第3索引平面上各标记的表达模式。
(A) 小提琴图显示了第5天iDiscoid scRNA-seq簇中ECM基因以及卵黄囊中胚层标志基因BST2的分布。
(B) 点图显示了第5天卵黄囊中胚层和内皮标志基因的一个子集。GATA6表达最高的细胞群体表达最高水平的YSM标志基因。左侧显示GATA6表达，其圆点大小的缩放方式与右侧标志基因列表不同。
(A) 散点图显示了第5天时通过对3次独立实验进行图像分析所获得的标志物分布。百分比对应于记录到的、相应标志物表达水平高于虚线所示阈值的细胞比例。
(B) 免疫荧光图像显示了 iDiscoid 培养中表达造血标志物的细胞。表达造血标志物 TAL1（Scl）的细胞定位于卵黄囊内胚层区室与组织培养皿之间。比例尺 = 100 µm
(C) 免疫荧光图像显示表达 RUNX1 和 TAL1 的细胞贴附于培养皿表面。比例尺 = 100 µm
(D) 对3个生物学重复中5个区域的 z 层切片进行图像分析。代表 iGATA6 内胚层的 EGFP 表达峰之下可见 ERG 表达峰。虚线曲线表示在各点计算得到的标准误（SEM）。
(E) 免疫荧光图像显示表达 VE-cadherin 和 VEGFR2 的细胞贴附于培养皿表面。箭头指示一个可能来源于上覆 iGATA6 层的分化中的内皮细胞。比例尺 = 100 µm
(F) 流式细胞术图显示了在以表达 CD34 的细胞（从 iDiscoids 中富集）起始的 CFU 测定后第14天检测到的造血标志物。
(G) 图像分析结果显示了 iDiscoid 培养第5天至第12天期间 CD34+ 细胞面积的变化，该结果通过免疫荧光图像分析评估得出。单个点代表生物学重复。**：P 值 = 0.0055
(H) 第5天和第12天 iDiscoid 的代表性流式细胞术图显示，到第12天 CD34+ 细胞群发生扩增（n=3）。
(A) 第12天 iDiscoids 中一部分 CD43+ 圆形细胞表达红系标志物（CD235a 和 Hemoglobin）。比例尺 = 100 µm
(B) 细胞表达髓系标志物（CD31、CD33）和巨噬细胞标志物（CX
(C) 第12天 iDiscoid 中表达巨核细胞标志物的细胞。比例尺 = 100 µm
(D) UMAP 显示了在第21天进行的 scRNA-seq 的无偏聚类。方框区域显示表达造血标志基因的细胞群。
(E) 将第21天 iDiscoid 细胞群与 Tyser 等人（2022）报道的人类胚胎 E16–19 细胞群进行超几何统计比较。红框显示了与体内造血谱系具有相似性的目标细胞群。iDiscoid 各聚类在 Y 轴上按相似命运进行分组。
(F) 图 D 中红框所示细胞群内造血标志基因的表达。这4个聚类显示出与卵黄囊来源造血细胞群相关的不同标志基因表达谱。
(G) 第21天 iDiscoid 的流式细胞术分析。在对所示标志物进行分群之前，先对细胞进行 CD43 阳性门控（n=2，显示代表性样本）。
(A) 在未额外补充 GATA6-hi 细胞的情况下，第 12 天 iDiscoid 中 CD43+ 和 Hemoglobin+ 细胞的表达。Hoechst 高信号区域中的红色为非特异性染色。比例尺 = 500 μm。插图显示 CD43+ 细胞区域。右侧虚线轮廓显示图像中放大区域的位置。比例尺 = 100 μm
(B) 在初始接种时补充 25% GATA6-hi 细胞的情况下，第 12 天 iDiscoid 中 CD43+ 和 Hemoglobin+ 细胞的表达。可观察到 CD43 表达细胞的显著扩增。比例尺 = 500 μm。图示为 2–4 个生物学重复中的代表性图像。
(A) 第 12 天 iDiscoid 在距底部焦平面所示高度处的 Z 层切片。中胚层标志物 Desmin 的表达局限于组织底部附近；内皮标志物 CD34 在组织底部和中部附近表达，且在 Desmin 上方（z = 6–8）表达最高；内胚层标志物 FOXA2 仅在其他组织上方表达。比例尺 = 50 μm
(B) 围绕 (A) 中所示类血岛区域的 Z 层切片
从初始混合状态开始，iDiscoid 细胞分离形成由 iGATA6 细胞包围的 WT 细胞簇。这些 iGATA6 细胞发生侧向迁移，在 WT 细胞簇顶部形成双层边界。随后，这些细胞簇经历腔形成、羊膜样细胞命运指定以及前部下胚层样和后部结构域的形成。在仅含 iGATA6 的区域中，卵黄囊中胚层发生命运指定，并可观察到造血细胞命运指定。
(A) 在 iDiscoid 中，第 12 天大多数对应于先前 WT 细胞簇的结构已开始表达 ISL1，并失去多能性标志物 SOX2 和 NANOG 的表达。少数细胞在先前 WT 细胞簇的核心区域表达 SOX2，这可能提示少量 WT 谱系细胞被指定为外胚层样命运。
(B) 先前 WT 细胞簇中的一部分已获得外胚层分化标志物的表达。比例尺 = 500 μm
(A) 示意图显示 iDiscoid 亲本细胞系的构建过程。携带可诱导 GATA6 回路且拷贝数异质的 iGATA6 细胞与野生型细胞混合。随后，该细胞组合在诱导前共同维持培养或冻存，用于 iDiscoid 实验。
(B) 经冷冻保存和复苏后的 iDiscoid 形态及特征。比例尺 = 500 μm
(C) 混合后立即诱导（传代 1）或共同维持培养并传代两个月（传代 15）的 iDiscoid 培养物的特征和形态。比例尺 = 500 μm
使用 iPSC 细胞系 PGP9 构建的 iDiscoid 在第 4 天的免疫荧光图像。
(A) 部分表达高水平 GATA6（EGFP）的 PGP9 iGATA6 细胞在 WT 细胞簇边缘附近也表达前部内胚层标志物 HHEX。
(B) PODXL 表达形成环状，衬于 PGP9 WT 细胞簇中形成的腔体内侧。
(C) ISL1+ 细胞在远离 NANOG+ 细胞的位置发生命运指定，沿着 PGP9 WT 中形成的腔体基部排列。
（D）TBXT+细胞在WT细胞簇边缘形成极性结构域。代表性细胞岛显示，可观察到细胞的同向极性排列和反向极性排列两种情况。
（方法中引用）通过SSC-A与FSC-A门控排除细胞碎片；通过比较FSC-A与FSC-H排除细胞聚集体；利用7-AAD染色识别阳性细胞并将死细胞门控排除。
本研究得到了匹兹堡大学病理学系启动基金的支持。我们感谢生物成像中心和匹兹堡大学流式细胞术核心设施提供的支持。造血细胞亚群的表征部分得到了美国国家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）授予M.R.E.的R01项目（HL141805）的支持。本研究中所使用的iPSC细胞系的建立与表征部分得到了美国国家生物医学成像与生物工程研究所（National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering）授予M.R.E.的R01项目（EB028532）以及美国国家科学基金会（NSF）项目#2134999的支持。已发表胚胎数据集的计算分析部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予Z.B.J.的项目1R01GM122096、OT2OD026682、1U54AG075931和1U24CA268108的支持。本研究还部分得到了匹兹堡肝脏研究中心（NIH/NIDDK P30DK120531）、组织工程与再生医学细胞方法培训项目（T32 EB001026）以及NIH 1S10OD019973-01的支持。我们感谢生物成像中心的Katherine Helfrich和Michael Calderon在成像相关工作中提供的帮助。我们还感谢Alaina Sutherland、Chloe Hislop和Raini Porterfield在本研究期间提供的有益讨论。文中展示的若干示意图使用Biorender制作。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545118
🏷️ 胚胎植入后发育 人类干细胞模型 胚外组织工程 GATA6诱导 自组织形态发生