- 2 次围观
胚胎干细胞（ESCs）能够自组织
通过利用胚胎干细胞的无限潜能及其自组织行为来工程化构建基于干细胞的胚胎模型（SEMs），哺乳动物胚胎发生研究正不断开辟新的前沿领域[
当前生成SEMs的方法依赖于以下部分或全部策略：（i）ESCs的随机分化[
通过外源性过表达决定细胞命运的转录因子编码序列，已被广泛用于细胞的可控分化或重编程。然而，染色质背景、辅助因子的存在、过高的表达水平以及表观遗传屏障，都可能限制外源转录因子的活性。我们假设，直接利用CRISPR激活内源性调控元件，能够克服与胚胎干细胞分化相关的表观遗传屏障[
作为对照，我们使用了表达非靶向对照sgRNA的小鼠胚胎干细胞（sgCtrl-mESCs），以及未接受多西环素处理的细胞（
内源性调控元件活性的变化与胚胎细胞分化以及发育过程中空间有序模式的形成密切相关。我们假设，激活最少数量的关键发育调控元件就足以形成空间有序的胚胎模式。为检验这一假设，我们将等量混合的sgGata6-mESCs、sgCdx2-mESCs和sgCtrl-mESCs接种于圆形微图案上，以形成大小可重复的细胞集落[
空间有序的胚胎模式如何从少数随机定位的单个细胞中产生？为回答这一问题，我们采用单细胞活体荧光成像来监测在CRISPRa编程的二维胚胎模式中空间组织形成的动态过程。为了对每一种CRISPRa诱导的细胞类型进行荧光可视化，我们设计了新的构建体，其中针对Cdx2的sgRNA与Clover-NLS共表达，而针对Gata6的sgRNA与mCherry-NLS共表达（
为检验这种增强的细胞运动是否伴随方向性，我们量化了单个微图案区域内细胞的角向运动。结果表明，与未诱导的sgGata6-mESCs和sgCdx2-mESCs相比，CRISPRa诱导细胞随时间表现出不同的角向运动模式，这种差异在sgGata6-mESCs中更为显著。诱导的sgGata6-mESCs在运动距离和运动方向上的集体变化，可能是这些细胞在组织形态发生过程中自我组织形成环状结构所必需的（
基于我们的发现，即CRISPRa诱导的胚胎细胞能够容易地形成具有空间组织性的二维图案，我们推断该方法可通过形成三维类胚胎结构，更加接近地重现天然胚胎发育模式。为此，我们将sgGata6-mESCs、sgCdx2-mESCs和sgCtrl-mESCs按1:3:1的比例接种于AggreWell 400培养板中。该体系通过将细胞限制于具有确定尺寸的微孔中，提高了三维细胞聚集体在大小和形状上的一致性。我们在CRISPRa诱导72小时后进行了免疫染色和共聚焦成像，以观察三维结构的空间组织（
起始细胞1:3:1（sgCtrl-:sgCdx2-:sgGata6-mESCs）的比例已被证明是先前发表的胚胎模型中的最佳条件[
我们对三维模型进行的定量单细胞图谱分析表明，CRISPRa诱导的细胞系能够容易且高效地自组织形成CPEMs，其空间特征与受精后第5至6天的小鼠胚胎相似，也与先前报道的小鼠胚胎模型相似[
为检验CRISPRa诱导细胞中单个细胞的分化状态，我们对来源于混合细胞群的CPEMs进行了单细胞RNA测序（scRNA-Seq）；同时作为对照，也对分别由各CRISPRa诱导细胞系单独形成的CPEMs进行了测序：仅sgCtrl-mESCs、仅sgGata6-mESCs以及仅sgCdx2-mESCs。对混合CPEMs的单细胞转录组数据进行无监督降维分析后，解析出6个聚类，这些聚类可根据CRISPRa诱导靶基因的表达清晰地区分开来（
为进一步验证单一细胞类型CPEMs免疫染色数据所得结果，我们还分析了仅由单一细胞类型生成的CPEMs的转录谱。与此一致，我们观察到仅由sgCtrl-mESCs生成的CPEMs缺乏分化（
我们设计该胚胎模型时，使三种细胞类型均从未分化的多能状态起始，并在接种细胞时通过诱导CRISPRa共同发育形成类胚胎结构。我们还排除了通过培养基中的重组蛋白或小分子递送外源刺激的做法，因为这些因素可能会对CRISPRa诱导的分化产生偏倚。我们假设，CRISPRa诱导细胞的共同发育能够促进三种细胞类型在自组织形成空间上彼此区分的胚胎图案过程中发生持续的信号串扰[
为分析不同细胞类型聚类之间潜在的信号通路配体-受体相互作用，我们使用了CellChat[
与大多数随机过程一样，ESC的随机分化无法精确控制构成胚胎模型的不同细胞类型的初始细胞组成，从而导致细胞组成和空间排列出现不同程度的变异性。对外源性分化线索的依赖，而这些线索在不同细胞类型之间往往彼此不相容，削弱了不同胚胎细胞类型在胚胎模型中的共同发育能力，因而无法充分捕捉天然胚胎发育过程中生理性的异质细胞信号传导[
此外，诱导的转录因子不会经历自然的转录后加工过程，如RNA剪接。随着利用不同物种基于干细胞的胚胎模型研究哺乳动物胚胎发生这一领域不断开辟新前沿，亟需对现有方法加以补充和改进，以便以简便且可控的方式生成胚胎模型，并提高其空间模式和细胞组成的可重复性[
我们研究中的一个有趣发现是，在多能细胞中仅内源性激活两个决定细胞命运的转录因子调控元件，就足以使细胞自组织形成胚胎样模式。基于这一简单原理，我们提出了一种直接的、基于CRISPR的表观基因组激活方法，在小鼠胚胎干细胞中诱导不同细胞命运，并使其自组织形成胚胎模型。只需将表达两种命运诱导性向导RNA的两类细胞，即Gata6、Cdx2以及非靶向对照，在不添加任何外源性线索的简单生长培养基中混合，我们就在3D培养模型中观察到清晰的空间组织：原始内胚层细胞（sgGata6-mESCs）包围着滋养层（sgCdx2-mESCs）和上胚层细胞（sgCtrl-mESCs）的内层，并伴随腔体形成。有趣的是，我们发现sgGata6诱导的类原始内胚层细胞在CPEMs的模式形成中发挥主要作用，这一点可由以下事实表明：当这些细胞不存在时，模式形成完全丧失；并且sgGata6细胞自身即可生成具有腔体的结构，这与既往关于Gata6在小鼠早期胚胎发育过程中细胞命运决定中发挥重要作用的研究结果一致[
我们对二维图案的延时荧光显微成像揭示了细胞引人入胜的集体行为，这些行为导致了自组织有序结构的形成。集体迁移的类PrE细胞的活跃增殖导致整个结构周围形成环状图案，而类TS细胞则聚集在一起，在结构内部形成局部簇，并且与类Epi细胞清晰分离。本质上，我们的结果表明，内在的细胞命运决定能够编码分子程序，这些程序通过细胞的集体运动与差异性生长的耦合，促成发育图案的形成。重要的是，我们表明结构的尺寸会影响自组织过程：类PrE细胞仅能在直径为80 μm或140 μm的较小生长区域中实现可重复的组织化，而在225 μm或500 μm的区域中则不能。这表明，在适宜的局部环境中，受协调的细胞运动、生长以及异质细胞间信号传导足以诱导形成自组织的类胚胎结构，而无需额外向培养基中加入形态发生素。
CPEM在分子层面上与近期发表的iETX和sEmbryo模型表现出相似性，在这些模型中，分别通过Gata6或Gata4的异位表达，或Cdx2的异位表达来生成PrE细胞或TS细胞。此外，CPEM还与培养3–4天的iETX胚胎模型相似，无论是在组织结构、细胞数量还是细胞比例方面均是如此[
我们预见，CPEM在未来实验中将具有多种应用，可用于研究功能性基因组元件如何塑造胚胎发育过程中的整体形态、细胞组成以及信号串扰。将一种可编程蛋白CRISPRa整合到胚胎模型中，将有助于开展大规模筛选，以检验主要细胞命运决定因子、增强子及信号因子在胚胎模型中空间图案形成中的作用。此外，我们的CRISPRa装置具有可诱导性，这将使得在胚胎模型中对调控元件的激活实现时间上的精确控制。我们也认识到该方法存在一些不足，这些问题可在未来将基于CRISPR的表观基因组编辑器应用于胚胎模型构建时加以解决。在我们的模型中，由Cdx2诱导产生的TS细胞在总数量上的贡献似乎略低，并且相对于Epi和PrE细胞，其发育时序可能也略有延迟，因为它们仍维持着残余水平的多能性因子。我们预计，通过激活多个TS富集转录因子的调控元件，可以生成发育程度更高的TS细胞。基于这一观察，我们进一步预期，利用诸如Cas12a这类可多重化的CRISPR同源系统靶向多个元件，能够提高胚胎模型中分化的保真度和时序一致性[
小鼠胚胎干细胞（mESC）在 2i+Lif 条件下培养，所用培养基为 ESGRO-2i 培养基（MilliporeSigma，SF016-200）+1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122），或添加了 1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122）、1uM PD0325901（StemRD）、3uM CHIR99021（StemRD）和 1000 U/ml Lif（MilliporeSigma，ESG1107）的 N2B27 培养基（Takara，Y40002）。mESC 在经 0.1% 明胶（Sigma G1890）包被的组织培养处理平板上生长。常规传代时，细胞以每 cm² 5,000–10,000 个细胞的密度接种。
为整合 PB-TRE3G-dCas9-VPR 盒（dCas9-VPR）（Addgene，#63800），使用 Lipofectamine Stem（Thermo Fisher Scientific，STEM00003）进行细胞转染，并以 OptiMEM（Thermo Fisher，31985062）稀释。简而言之，mESC 按前述方法接种于经 0.1% 明胶包被的 6 孔板中，每孔接种 300,000 个细胞。次日，用以下以 OptiMEM 稀释的质粒对细胞进行转染：PiggyBac Transposase（200 ng）、dCas-VPR（800 ng）和 pUC19（1000 ng）。作为非整合对照转染，采用以下条件：dCas-VPR（800 ng）和 pUC19（1200 ng）。转染后 6 小时更换培养基。转染后 48 小时，通过加入 100 ug/ml Hygromycin（Mirus Bio，MIR5930）筛选成功整合的细胞，持续 4 天，或直至对照细胞全部消失。
pSLQ1371-sgRNA 盒（Addgene，121425）通过慢病毒转导进行整合。为制备慢病毒，将 HEK293T 细胞接种于 6 孔板中，每孔密度为 500,000 个细胞，培养基组成为 DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）、1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122）和 10% HIFBS（Thermo Fisher Scientific，10438026）。次日，每孔将培养基更换为 2 ml DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）和 10% ESC qualified FBS（MilliporeSigma，ES-009-B）。随后，使用 Turbofect（Thermo Fisher Scientific）并采用以下质粒进行转染：VSVG（300 ng）、DR8.74（450 ng）、pSLQ1371-sgRNA（750 ng）。转染后 6 小时，加入 1 ml DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）、3x Pen/Strep（终浓度为 1x）（Thermo Fisher Scientific，15140122）以及 10% ESC qualified FBS（MilliporeSigma，ES-009-B）。转染后 72 小时收集培养基于离心管中以获取慢病毒，随后以 500 rcf 离心。接着，将上清液通过 0.45 um 滤膜（MilliporeSigma，SLHVM33RS）过滤，并收集至新的离心管中。
对于慢病毒转导，将mESCs以每孔50,000个细胞的密度接种于预先包被0.1%明胶的6孔板中。次日，将培养基更换为1 ml 2i+Lif培养基和1 ml预制慢病毒。慢病毒孵育24小时后，再次将培养基更换为仅含2i+Lif的培养基。为筛选已转导细胞，在慢病毒转导48小时后加入0.8 ug/ml嘌呤霉素（Stemcell Technologies，73342），并持续添加4天，或直到对照细胞（未转导细胞）全部消失。
采用上述方法，构建了3株mESC细胞系，分别携带对照非靶向gRNA、靶向Gata6的gRNA以及靶向Cdx2的gRNA[
为验证这3株CRISPRa细胞系，通过免疫荧光染色诱导靶基因表达。将mESCs接种于包被0.1%明胶的24孔板中。根据实验持续时间，按以下密度接种细胞：24小时处理，每孔50,000个细胞；48小时处理，每孔25,000个细胞；72小时处理，每孔12,500个细胞；96小时处理，每孔6,250个细胞。每次染色中，sgCtrl-mESC、sgGata6-mESC和sgCdx2-mESC均重复接种，以分别进行多西环素处理和无多西环素对照处理。细胞接种于标准分化培养基中：DMEM+Glutamax、15% ESC认证FBS、1×丙酮酸钠（Thermo Fisher，11360070）、1×非必需氨基酸（Thermo Fisher，11140050）、1×青霉素/链霉素以及0.1 mM β-巯基乙醇（Thermo Fisher，21985023）。在处理孔中加入终浓度为0.5 ug/ml的多西环素（Millipore Sigma，D5207）。每24小时更换一次培养基，直至进行免疫荧光染色。细胞处理方法如下：加入0.4 ml溶于1×PBS中的3.6%甲醛（Avantor，JTS898-7），于室温孵育10分钟。每孔用1×PBS清洗两次，随后加入溶于1×PBS中的0.2% Triton-X100（VWR，97063-864）孵育20分钟。每孔再用1×PBS清洗一次，随后加入0.4 ml封闭液，在室温孵育1小时；封闭液组成为1×PBS中的3% BSA + 0.1% Triton（封闭液）。移除封闭液后，每孔加入0.4 ml一抗孵育液，其组成为1×PBS中的1% BSA，并按下表所示加入相应稀释比例的抗体。培养板于4°C孵育过夜。
第二天，移除一抗孵育液，孔用含 0.1% Tween 的 1x PBS 清洗两次，再用 1x PBS 清洗一次。使用 0.4 ml 二抗溶液，其组成为 1x PBS 中含 1% BSA，并按下表所示加入稀释后的抗体。平板于室温孵育 1 小时。移除二抗溶液后，用含 0.5 ug/ml DAPI + 0.1% Tween（BioRad，1610781）的 1x PBS 孵育各孔 5 分钟。孔先用含 0.1% Tween 的 1x PBS 清洗一次，再用 1x PBS 清洗两次。成像前，每孔加入 0.5 ml 1x PBS。除非另有说明，所有清洗步骤均为 3 分钟，每次体积约 0.5 ml。免疫荧光和相差图像使用 Lionheart FX 系统（Agilent BioTek）结合 Gen5 软件（3.14）采集。每孔采集 16 张图像，使用相差、DAPI、GFP 和 TexasRed 通道。图像在 ImageJ 中处理。按通道加载图像堆栈，并利用每种条件下的 DAPI 染色创建二值掩膜，以识别单个细胞核区域。随后，使用 DAPI 掩膜测量 GFP 和 TexasRed 通道中染色信号的强度。以此方式提取所有条件下每种染色每个细胞核的平均强度，并使用 ggplot2 [ 进行绘图。
对于微图案培养和终点免疫荧光染色，使用 Cytoo Arena A 微芯片（CYTOO，10-020-00-18）。将芯片置于已加入 3 ml 1x PBS 的 6 孔板中。随后移除 1x PBS，加入 3 ml 4 ug/ml 的 Laminin（溶于 1x PBS），并置于细胞培养箱中于 37°C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。每孔加入 6 ml 1x PBS 后再移除 6 ml 溶液以进行清洗，重复 5 次。然后每次处理一个孔，移除全部溶液，加入 3 ml 2i+Lif 培养基 + 10uM ROCK 抑制剂（Stemcell Technologies，72304）。平板置于培养箱中，待当天需要时使用。接种细胞时，分别收集 sgCtrl-mESCs、sgGata6-mESCs 和 sgCdx2-mESCs，计数后按 1:1:1 比例混合。随后每孔加入 120,000 个细胞（每个细胞系 40,000 个）。2 小时后，将培养基更换为标准分化培养基：DMEM+Glutamax、15% ESC 级 FBS、1x 丙酮酸钠、1x 非必需氨基酸、1x Pen/Strep 和 0.1 mM β-巯基乙醇，并在处理组孔中加入强力霉素。培养基每日更换，每次处理一个孔。细胞在微芯片上培养 72 小时后进行免疫荧光染色。
为进行免疫染色，首先去除 Cytoo Arena A 微芯片中的培养基，并用 1× PBS 清洗孔一次；随后每孔加入 3 ml 溶于 1× PBS 的 3.6% 甲醛，并在室温下孵育 30 分钟。每孔用 1× PBS 清洗两次后，将微芯片从 6 孔板转移至单独的 35 mm 培养皿中，每个微芯片对应一个培养皿，且其中预先加入 3 ml 1× PBS。随后以 3 ml 溶于 1× PBS 的 0.2% Triton 溶液替换原溶液，并在室温下孵育 30 分钟。每个培养皿用 1× PBS 清洗一次后，加入 3 ml 封闭液，在室温下孵育 2 小时；封闭液组成为 1× PBS 中含 3% BSA 和 0.1% Triton。去除封闭液后，每皿加入 2.5 ml 一抗孵育液，其组成为 1× PBS 中含 1% BSA，并按下表所示加入稀释后的一抗。培养皿于 4°C 过夜孵育。
次日，去除一抗孵育液后，培养皿用 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液清洗两次，再用 1× PBS 清洗一次。随后每皿加入 2.5 ml 二抗孵育液，并在室温下孵育 2 小时；二抗孵育液组成为 1× PBS 中含 1% BSA，并按下表所示加入稀释后的抗体。去除二抗孵育液后，培养皿加入 0.5 ug/ml DAPI 和 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液，孵育 10 分钟。随后培养皿用 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液清洗一次，再用 1× PBS 清洗两次。成像前，每皿加入 3 ml 1× PBS。除非另有说明，所有清洗步骤均持续 5 分钟，体积均为 1 ml。免疫荧光图像采用 Zeiss LSM
对于每个通道，首先对平铺采集的图像扫描进行拼接，随后在 Zeiss ZEN 软件中对 z 堆栈（11 层图像堆栈，z 轴间隔为 3.19 μm）进行最大强度投影。所得图像按通道导入 Napari，并使用 StarDist（stardist-napari 2022.12.6）进行分割。所采用的设置如下：模型类型：2D。预训练模型：Versatile（荧光细胞核）。图像归一化：是，百分位下限 = 1.00，百分位上限 = 99.80。概率/评分阈值：0.6。重叠阈值：0.5。输出类型：仅标签。归一化轴：ZYX。时间序列标签：与前一帧匹配（基于重叠）。使用每个区域的方形形状图层提取并裁剪各个独立区域。对于每个通道，采用 RegionProps（napari-skimage-regionprops 0.10.1）对分割数据进行分析，以提取每个单独分割细胞的位置、大小及信号强度，并导出为数据表。使用 ggplot2 绘制各区域细胞的数量和比例。采用 ggplot2 的 geom_bin2d 选项并设置 15 个分箱绘制密度图。对于每个区域，基于质心数据，将 x/y 坐标缩放至 0–1 范围，其中 0 表示沿 x/y 轴第一个细胞所在的最小像素位置，1 表示最后一个细胞所在的最大位置，以校正尺寸和裁剪上的微小差异，从而更好地捕捉平均模式。
对于不同共培养 mESC 细胞系的活细胞成像与追踪，对 pSLQ1371 sgRNA 质粒进行了修饰，将其中的 mCherry 替换为 Clover 或 mTagBFP。另在每种荧光蛋白的 C 端添加了 Myc 核定位信号（NLS）（即 mCherry-NLS、Clover-NLS 和 mTagBFP-NLS）。如前所述，通过慢病毒转导将分别编码 sgCtrl-mTagBFP-NLS、sgGata6-mCherry-NLS 或 sgCtrl-Clover-NLS 的 DNA 导入稳定整合诱导型 dCas9-VPR 的 mESC 细胞系。
对于活细胞微图案培养，使用了 RosetteArray™（Neurosetta，Spinal 6-Well 100µm RosetteArray™ Plate）六孔板，其生长区域为 100 µm。各孔先用 1× PBS 清洗一次，随后加入 3 ml、浓度为 4 µg/ml 的 Laminin（溶于 1× PBS），并在细胞培养箱中于 37°C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。随后每次处理一个孔，每孔用 3 ml 1× PBS 清洗一次。接着，同样每次处理一个孔，移除全部溶液并加入 2 ml 标准分化培养基。培养板随后置于培养箱中，待当天使用。分别收集 sgCtrl-mTagBFP-NLS-mESCs、sgGata6-mCherry-NLS-mESCs 和 sgCdx2-Clover-NLS-mESCs，进行计数后按 1:1:1 的比例混合。随后每孔加入 400,000 个细胞（每个细胞系 133,000 个），加入体积为 1 ml，使每孔总体积达到 3 ml。6 小时后，向处理孔中加入强力霉素。培养基每日更换一次，每次处理一个孔。进行活细胞成像时，将培养板置于配备湿度腔、温度（37°C）和 CO2（5%）控制的 Lionheart FX 成像仪中。使用相差、YFP 和 TexasRed 通道，每小时成像一次，总计 48 小时。
由 Lionheart FX 获得的拼接图像使用 Gen5 3.14 软件进行拼接。将延时成像数据作为图像堆栈导入 imageJ，对单个微图案区域进行裁剪，并按通道保存为独立的图像序列。对于每个微图案区域，将延时成像数据作为堆栈导入 Napari。使用 StarDist 并启用随时间标记选项对细胞进行分割。随后，使用 Btrack 插件（0.6.4）对延时成像数据中的单个细胞进行追踪，并导出为 h5 文件。采用 Btrack 默认的“cell”设置，但将 Motion Accuracy 提高至 10。对于活细胞数据视频，在 Napari 中对各图层进行排列和/或叠加，并使用 wizard 插件（napari-animation 0.0.7）导出。对于细胞动态的详细分析，从 h5 文件中提取细胞位移数据并导出为 .csv 文件格式，随后使用 CelltrackR（1.1.0）进行进一步处理。
为了在三维结构中培养并分化 mESC，将细胞接种于 24 孔 AggreWell 400 板（Stemcell Technologies，34415）中。每孔先用 1× PBS 清洗一次，随后加入 0.5 ml 抗黏附溶液（Stemcell Technologies，07010）。将培养板以 1,000 rcf 离心 5 分钟，并在室温下孵育 20 分钟。去除抗黏附溶液后，每孔加入 1 ml 1× PBS。在接种细胞前，将培养板保持于室温。接种前即刻去除 1× PBS，并加入 1 ml 标准分化培养基 + 20 uM ROCK 抑制剂。对于处理孔，加入 1 ug/ml 多西环素。分别收集、计数并将 sgCtrl-mESC、sgGata6-mESC 和 sgCdx2-mESC 按 1:1:3 的比例混合。随后，每孔加入 32,000 个细胞（6,000 个 sgCtrl、6,000 个 sgGata6 和 20,000 个 sgCdx2），总体积为 1 ml，使每孔总体积达到 2 ml，且 ROCKi 的终浓度为 10 uM，多西环素的终浓度为 0.5 ug/ml。24 小时后，每孔更换 1.4 ml 培养基，使用不含 ROCKi 的标准分化培养基，并重复一次。再经过 24 小时后，每孔再次更换 1.4 ml 培养基。在处理条件下，每次换液时均加入多西环素。对于细胞比例发生改变的条件，则相应调整细胞数量。
培养72小时后，制备CMEMs用于免疫染色。每孔移除1.5 ml培养基，并加入1.5 ml 1x PBS。将CPEMs静置沉降1分钟，然后每孔移除1.5 ml该溶液。每孔加入0.5 ml 1x PBS。通过轻敲培养板和/或上下吹打，使用剪口P1000枪头以防止剪切损伤，使CPEMs重悬，随后转移至预先加入2 ml 1x PBS的6孔板中。每孔加入一个40 um细胞滤网（Corning，087711），并剪去侧边标签，使其形成屏障，以防从孔中吸取溶液时将CPEMs一并吸走。吸取溶液时，将培养板轻微倾斜，使约0.5至1 ml溶液保留在孔中，以保持CPEMs处于悬浮状态。随后以此方式移除1x PBS，并用2 ml 1x PBS中的3.6%甲醛洗涤每孔，之后每孔加入2 ml 1x PBS中的3.6%甲醛，并于室温下置于轨道摇床上孵育40分钟。孵育期间，移除细胞滤网以改善CPEMs与缓冲液的混匀。洗涤过程中，短暂移除细胞滤网，并在每次加入洗液后重新插入，以促进溶液混匀。吸去甲醛溶液后，先用1次1x PBS + 0.01% Tween + 1x Glycine（Cell Signaling Technology，#7005）洗涤，再用1x PBS + 0.01% Tween洗涤2次。各孔再用1次1x PBS + 0.2% Triton-X100洗涤，随后加入2 ml 1x PBS + 0.2% Triton X-100，并于室温下置于轨道摇床上孵育30分钟。移除溶液后，用封闭缓冲液（1x PBS + 3% BSA + 0.1% Triton-X100）洗涤1次，随后加入2 ml封闭缓冲液，并于室温下置于轨道摇床上孵育2小时。移除溶液后，用抗体孵育缓冲液（1x PBS + 3% BSA）洗涤1次，随后每皿加入2 ml一抗孵育液，其中包含按下表稀释的抗体。培养皿于4°C下置于轨道摇床上过夜孵育。
移除一抗溶液后，各孔用1x PBS + 0.1% Tween洗涤3次。各孔再用抗体孵育缓冲液（1x PBS + 3% BSA）洗涤1次，随后每皿加入2 ml二抗孵育液，其中包含按下表稀释的抗体。培养皿于4°C下置于轨道摇床上过夜孵育。
移除二抗溶液后，各孔用1x PBS + 0.1% Tween洗涤2次。每孔加入2 ml DAPI孵育液，其组成为1x PBS + 0.01% Tween + 2 ug/ml DAPI，并于室温下置于轨道摇床上孵育10分钟。各孔再用1x PBS洗涤2次，随后加入2 ml 1x PBS + 0.1 sodium azide保存。
为进行成像，将 CPEM 转移至玻璃底 8 孔腔室载玻片（Ibidi，80827）中。向 8 孔腔室载玻片的每个孔中加入 250 ul 的 1x PBS + 90% 甘油（Millipore Sigma，G2025）+ 0.1% 叠氮化钠。缓慢旋转装有 CPEM 的 6 孔板，使 CPEM 聚集于中央，然后吸取 50 ul 加入 8 孔腔室载玻片的孔中。盖上 8 孔腔室载玻片盖，并用透明指甲油（Ted Pella，114-7）封口。载玻片于 4°C 过夜保存，使 CPEM 在成像前沉降。使用 Zeiss 880 共聚焦显微镜对 CPEM 进行成像，采用 20x 长工作距离物镜。为进行 z 轴方向的光学切片，图像以每 3.89 um 的间隔采集一次。
将图像堆栈导入 imageJ，并从每个图像堆栈中裁剪出单个 CPEM，按通道分别保存为独立的图像序列。将每个 CPEM 的各通道图像序列导入 Napari，并使用 StarDist（stardist-napari 2022.12.6）进行分割。采用以下设置：模型类型：2D。预训练模型：Versatile（荧光细胞核）。图像归一化：是，percentile low = 1.00，percentile high = 99.80。概率/评分阈值：0.6。重叠阈值：0.5。输出类型：仅标签。归一化轴：ZYX。时间序列标签：与前一帧匹配（通过重叠）。分割标签层中属于其他 CPEM 的残余部分被删除，因此仅分析单个完整 CPEM 的数据。对于每个通道，使用 RegionProps（napari-skimage-regionprops 0.10.1）对分割数据进行分析，以提取每个独立分割细胞的位置、大小和信号强度，并导出为数据表。采用以下参数对数据进行筛选：平均强度 >400（Pou5f1）和 >200（Cdx2、Foxa1）的细胞核纳入后续分析。面积 >400 且
CPEM按照先前描述的方法培养72小时。每孔移除1.5 ml培养基，并加入1.5 ml 1× PBS。随后移除其中1.5 ml该溶液，并向每孔加入0.5 ml 1× PBS，使用剪口移液枪头将CPEM转移至微量离心管中。离心管以300 rcf离心5分钟。去除上清液后，将CPEM轻柔重悬于1 ml DMEM/F12（Thermo Fisher，11039021）中，随后再次以300 rcf离心5分钟。去除上清液后，将CPEM重悬于1 ml Trypsin-EDTA中。在37°C孵育5分钟前，将CPEM上下吹打3次。随后将CPEM上下吹打6次，并向每管中加入200 ul ESC级合格FBS，之后以300 rcf离心5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于0.5 ml标准分化培养基中并转移至冻存管。取样测定细胞活力，活力>80%的样本用于后续应用。向每个冻存管中加入0.5 ml 2×冻存液，所述冻存液由85% ESC级合格FBS / 15% DMSO组成，并轻柔混匀。将冻存管置于细胞冻存盒中，于−80°C过夜孵育，随后在液氮（气相）细胞储存系统中保存，直至进行单细胞RNA测序制备。每个冻存管约冻存100万个细胞。每个样本均从同一批次CPEM中额外冻存一管。该额外冻存管在进行单细胞RNA测序制备前被复苏，并再次评估细胞活力。
冻存管被送至美国圣何塞Novogene公司进行处理，在该处按照10X Genomics v3单细胞3’ RNA-seq文库制备方案进行样本制备。共制备4个样本，每个样本捕获5,000个细胞，并进行平行测序（NovaSeq 6000），每个样本的双端测序输出为200M reads，最终每个样本中每个细胞约获得40,000个双端reads。
Fastq文件使用kallisto-bustools进行比对，基因计数和条形码数据亦采用该工具进行处理[
所得输出矩阵经过过滤并转换为seurat文件（Seurat 5.0.1）[
所获得的seurat文件用于生成所示的umap图、featureplot和dotplot。混合细胞CPEM样本的seurat文件还用于使用CellChat（2.1.1）进行配体-受体相互作用分析，代码如下：
单细胞RNA测序分析的原始数据、计数矩阵、seurat文件和CellChat文件可在GEO数据库中获取，登录号为GSE256138。
S.A、G.A.L 和 S.K 构思了该项目，开展了实验并分析了大部分结果。S.A 和 G.A.L 撰写了论文并制作了图表。C.H 进行了免疫染色并分析了 3D 胚胎模型的共聚焦图像。A.Z 和 S.L 参与了活细胞成像 2D 微图案实验的分析。L.S.Q. 对论文和 CRISPR 资源提供了反馈。G.K 和 R.A 制备了用于活细胞成像实验的微图案培养皿。B.R.T 建立了使用 2D 微图案培养的初始实验并审阅了论文。
本研究获得了 NIGMS/NIH Pathway to Independence Award K99GM126027/R00GM126027、Maximizing Investigator Award（R35GM147395）以及加利福尼亚大学圣克鲁兹分校提供的启动经费包（S.A.S）的资助。G.A.L. 获得了荷兰研究理事会（NWO）Rubicon 奖学金的资助。B.T 获得了美国国立卫生研究院（NIH，资助编号 K12GM139185）以及加州大学圣克鲁兹分校干细胞生物学研究所（IBSC）的资助。G.K 和 R.A 获得了 NIH/NIEHS FastTrack STTR Award（R42ES033912）的资助。本文内容完全由作者负责，并不一定代表 NIH 或 IBSC 的官方观点。技术支持由加州大学圣克鲁兹分校生命科学显微中心 Benjamin Abrams 提供，RRID：SCR_021135。
G.K 和 R.A 是 Neurosetta 的联合创始人，该公司专注于 RosetteArray 平台的商业化。
我们感谢 Camilla Forsberg 博士、Russ Corbett-Detig 博士和 Euiseok Kim 博士对我们论文提出的反馈意见。我们还要感谢 Shariati 实验室的成员，尤其感谢 Dr. 对论文提出的反馈。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583597
🏷️ 胚胎干细胞 表观基因组编辑 CRISPR激活 自组织 胚胎模型