- 3 次围观
详细的蛋白质组图谱对于理解分子通路和蛋白质功能至关重要。尽管样品制备、仪器设备和数据分析方面已取得显著进展，单细胞蛋白质组学目前仍受限于蛋白质组覆盖深度和定量性能。我们将一根具有零死体积末端的高通量色谱柱与以DIA模式运行的 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ 质谱仪相结合。我们证明了该方法在超低输入量条件下实现了前所未有的蛋白质组覆盖深度，以及定量的准确性和精密性。通过使用定制谱库，我们在每天50个样本（SPD）的通量下，仅用250 pg HeLa样品即可鉴定多达7400个蛋白质组。我们对多种数据分析策略进行了基准比较，评估了其对FDR的影响，并表明蛋白质水平的FDR可以较容易地维持在1%。利用双蛋白质组混合样品，我们检验了定量的最佳参数，并表明即使在单细胞水平输入量下，仍可成功检测出2倍的倍数变化差异。最终，我们将该工作流程应用于A549细胞，在单个细胞中获得了多达5300个蛋白质组的覆盖度，从而能够观察细胞群体中的异质性，并研究细胞大小与细胞周期阶段之间的依赖关系。此外，我们的工作流程还使我们能够区分
基于质谱的单细胞蛋白质组学（SCP）已发展成为一种强有力的技术，能够以不断提升的覆盖度和通量研究细胞异质性。为应对超低输入量这一挑战，多个实验室开发了大量微型化和自动化的样品制备工作流程。
Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ 质谱仪的近期引入
在这里，我们研究了 Orbitrap Astral 质谱仪与 Aurora™ Ultimate TS 25 cm 纳升级超高效液相色谱（UHPLC）柱联用时的性能；该色谱柱配备了完全集成的离子源接口，以尽量减少峰展宽并获得尽可能高的信号强度。我们优化了梯度长度，以实现最大的蛋白质组覆盖度，并评估了定量的准确性和精密性。
得益于上述方法学改进所产生的协同效应，单细胞蛋白质组学如今进入了一个新阶段，成为生物学家用于补充单细胞基因组学数据的重要工具。
我们将 Orbitrap Astral MS 与 Thermo Scientific™ FAIMS Pro 接口以及 Auroa Ultimate 25 cm TS 色谱柱（集成喷射尖端且零死体积）相结合，旨在最大限度提高超低输入蛋白质组样本的灵敏度。为了获得一个在评估与基准测试中可代表单细胞相当输入量的标准样品，我们决定分别进样 250 pg 商业化 HeLa 和 K562 肽段。将总体酶解产物稀释于含有 0.015% N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的 0.1% TFA 中，以改善肽段溶解性、重复性和定量准确性。
基于我们的结果，我们推测较短的梯度更有利于超低输入样本，因为其可产生更尖锐、因而峰强更高的色谱洗脱峰。一旦在 50 SPD 达到最大值，更快的梯度可能会因分离能力不足和谱图复杂性增加而受到影响，从而不利于鉴定数量。具有极窄洗脱峰的快速梯度还会进一步减少每个峰的数据点数（
接下来，我们利用同一批 HeLa 和 K562 酶解产物中的 10 ng 样品构建了一个定制文库，以进一步提高蛋白质组覆盖度。这些文库同样以 DIA 模式采集，并在文库中鉴定出超过 62,000 个前体离子（
为估算真实的错误发现率，我们通过打乱目标数据库中所有序列，同时保持所有蛋白酶切割位点（P、K 和 R）的位置不变，构建了一个打乱的目标数据库。在后续检索中，这两个数据库均作为目标数据库使用。它们共享的肽段少于 0.01%，且规模相近，从而能够对 FDR 进行公平估计，同时在打乱的目标数据库中发现代表真实阳性命中的肽段的风险极低（
分别进样了来自稀释总体酶解产物的 250 pg 或 10 ng HeLa 肽段，这与图中所示结果一致
在考察图中所示的 HeLa 数据时
然而，通过汇总 3 次重复实验中的所有唯一鉴定结果来报告总 ID 数（补充图 1），若不额外进行 FDR 过滤步骤，会累积错误鉴定的前体离子和蛋白质。这将导致 FDR 升高，最高可达 2.7%（补充图 2）。因此，作者建议报告平均 ID 数，而非总 ID 数。
为了获得尽可能高的灵敏度，我们使用 FAIMS Pro 接口筛选了最佳补偿电压。根据既往经验，-48 V 在所用设备上可获得最佳结果，因此该电压被用于所有其他运行。以 10 V 为步长在 –38 至 –88 V 范围内筛选补偿电压表明，最佳设置位于 -48 至 -68 V 之间；与其他任何设置相比，-58 V 下检测到的蛋白质组数略多，且前体离子数明显更多。尽管使用 FAIMS Pro 接口存在损失部分离子的风险，但由于其可改善信噪比并提升动态范围，因此使用该接口似乎仍然具有优势。
根据我们的实验结果，在最佳设置下使用 FAIMS Pro 接口可显著提高信噪比（补充图 9），与未使用 FAIMS 接口的测量相比，最多可多鉴定 42.6% 的前体离子和 55.3% 的蛋白质组。
每次进样均为来自稀释整体酶解样品的 250 pg HeLa 肽段。肽段以 50 SPD 的通量进行分离。在连接或不连接 FAIMS Pro 接口单元以及给定补偿电压的条件下记录数据。
随后，我们评估了该工作流程在单细胞水平输入下的定量性能，并在相似设置、相同输入量和相同梯度长度条件下，将数据与我们的 Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480 质谱仪进行基准比较。
尽管变异系数能够合理估计技术重复之间的定量精密度，我们还进一步利用双蛋白质组混合物评估了定量蛋白质的准确性和精密度。
每次进样均为来自稀释整体酶解样品的 250 pg 双蛋白质组混合物，其组成分别为 150 pg HeLa + 100 pg 酵母或 200 pg HeLa + 50 pg 酵母。肽段以 50 SPD 的通量进行分离。数据以 DIA 模式采集，对 Orbitrap Astral MS 和 Orbitrap Exploris 480 MS 分别采用各自优化但不完全相同的设置（见方法部分），并使用 Spectronaut 18 中的 direct DIA+ 在 1% FDR 下进行分析。定量在 MS1 水平上完成。Bland–Altman 图（下方）中的点表示在两种蛋白质组混合物中具有给定 log2 平均丰度和丰度 log2 倍数变化的蛋白质。密度图（右侧）描绘了测得的 log2 倍数变化分布，CV 图（上方）显示了在整个丰度范围内采用滚动窗口对 100 个蛋白质进行定量所得的局部 CV，n=3。
我们的结果表明，与 Orbitrap Exploris 480 MS 相比，Orbitrap Astral MS 可定量的蛋白质数量超过其两倍，这很可能归因于其更高的速度和灵敏度。当筛选两种仪器中共同检测到的蛋白质时，
进一步增加一个过滤条件以排除仅基于单条肽段定量的蛋白质，不会影响准确性，但可进一步提高定量精密度，且这一现象与所使用的仪器无关（补充图 4）。作为代价，可定量蛋白质的数量减少了 17%（Orbitrap Astral MS）至 28%（Orbitrap Exploris 480 MS）。我们还通过在酵母含量上设置更大的 5:1 和 10:1 倍数变化研究了准确性和精密度（补充图 5），结果显示出与上述相似的趋势。
我们认为，这些数据也为未来的生物学应用提供了有价值的参考，尤其是那些旨在评估单细胞蛋白质组学中能够被可靠识别所需的最小倍数变化调控幅度的研究。
为了确定使用 cellenONE 机器人进行无标记样品制备的最优策略，我们对该平台上已建立的一些方案进行了基准测试。我们决定采用本课题组此前发表的 one-pot 384 孔样品制备方法。
在我们的首次尝试中，proteoCHIP LF48 相较于 one-pot 384 孔工作流程表现出明显更优的性能，鉴定到的蛋白质组数量多出 48%。然而，在使用 LF48 芯片鉴定到的 1979 个蛋白质组中，有 693 个（35%）也在空白对照中被鉴定到；该空白对照包含所有试剂，并接受了与单细胞样本相同的处理，但未加入细胞（补充图 3A）。为降低背景信号，我们对特氟龙材质的 LF48 芯片实施了严格的清洗流程。结果显示，空白对照的背景水平降低至与 384 孔板相当的水平，但鉴定数量也下降至 1128 个蛋白质组，略低于我们使用 384 孔板获得的结果（1341 个蛋白质组）。我们推测，污染肽覆盖在（未经严格清洗的）重复使用 LF48 芯片的表面，并充当了载体，但同时也可能掩盖了真实的（受调控的）蛋白质。
随后，我们将较新的 EVO96 芯片原型（由聚丙烯制成，经过多次使用和清洗）与 one-pot 384 孔方案进行了比较，结果表明，即使在 384 孔板具有更低背景的情况下，384 孔板仍获得了更多的蛋白质组鉴定。仅选择较大的（>20 μm）A549 细胞时，使用 one-pot 384 孔工作流程平均可鉴定 3690 个蛋白质组，而使用 EVO96 芯片并进行一次样本转移至 96 孔低吸附板时，仅可鉴定 2348 个蛋白质组（补充图 3B）。
我们得出结论，在我们的实验条件下，one-pot 384 工作流程似乎最适合用于样本制备，因为其鉴定数量具有竞争力，甚至更优，且操作更为简便，无需转移步骤，也无需去除十六烷。此外，我们认为报告空白对照对于检查背景污染具有很高的重要性，尤其是在芯片材料重复使用的情况下，这一问题更为突出。因此，本研究中的所有单细胞样本均采用 one-pot 384 孔方法进行制备。
A549 是一种人非小细胞肺癌细胞系，常用于基础研究和药物发现。我们决定使用该细胞系对我们的工作流程进行原理验证研究。利用 cellenONE 机器人采集了三种不同大小组别的细胞，其直径范围为 15–30 μm。使用 Orbitrap Astral 质谱仪对 66 个 A549 单细胞和 3 个空白样本进行了测定。正如预期，鉴定到的蛋白质组数量与细胞大小相关（
通过 FACS 将单个细胞分选至 384 孔板中。消化后的细胞以 50 SPD 进行分析，液相色谱和质谱参数采用先前在 Orbitrap Astral 质谱仪上优化得到的设置。
随后，我们考察了这些培养且未经处理的 A549 细胞的细胞异质性程度，并通过主成分分析（PCA）发现，细胞根据其直径呈现出不同的聚类模式（
需要注意的是，本研究未进行细胞周期控制，因此我们的细胞群体反映了处于各个周期阶段的混合状态，这妨碍了清晰分离，但仍然能够成功研究该系统的异质性。
为进一步检验我们的分析型 LC-MS/MS 平台以及 SCP 的能力，我们分析了初始态 hPSC，并由其诱导产生 TE-like 细胞。在第 4 天收集 TE-like 细胞，并使用 FACS 分选 TROP2+ 细胞。我们评估了不同的分析策略（图 8A）。采用基于文库的方法，我们分别在 TE-like 细胞和初始态 hPSC 中鉴定出 2339 个和 2544 个蛋白质组。
为确认 SCP 能够重现初始态 hPSC 与 TE-like 细胞之间已知的差异，我们对数据集中所有细胞进行了降维分析，采用线性 PCA 和非线性 UMAP 聚类分析。我们观察到这两类细胞群体在两种方法下均表现出明显分离（图 8B、C），且与细胞类型一致。PCA 显示解释方差分别为 51.8%（PC1）和 4.9%（PC2）。
对 TE-like 细胞中上调蛋白进行的基因本体论（GO）分析显示，以下生物过程显著富集：细胞骨架组织（GO:0007010）、肌动蛋白细胞骨架组织（GO:0030036）、上皮细胞分化（GO:0030855）、上皮发育（GO:0060429）、细胞分化的正调控（GO:0045597）以及细胞分化（GO:0030154）；这些过程与先前描述的 hPSC 向 TE-like 细胞分化的基础生物学过程相一致。
我们关于初始态 hPSC 和 TE-like 细胞的单细胞蛋白质组数据表明，单细胞蛋白质组学具备区分原代细胞并提取有意义生物学信息的能力，这些信息可对转录组数据的结果形成补充并加以丰富。
尽管在过去十年中，基于质谱的超低输入蛋白质组学领域已经取得了巨大进展，但要同时实现高样本通量、可重复性、定量准确性、精密度和高灵敏度，仍然极具挑战性。本文提出的工作流程旨在通过以下组合满足这些标准：采用高性能零死体积柱并配合短梯度分离，结合最先进、快速且高灵敏度的质谱仪之一，基于 FAIMS 的噪声降低策略以及基于 DIA 的采集方式。所使用的填充床色谱柱在柱末端直接集成了拉制喷针发射器，从而最大程度地减少了峰展宽；同时，在样品上样过程中采用高流速，进一步提高了通量。LC 流速在有效梯度期间被降低，以增强灵敏度。我们发现，总通量达到 50 SPD 是一个最佳平衡点，既能最大化样品采集速度，又能保持足够的测量时间，从而在每个洗脱峰上检测到中位数为 5 个数据点，保证适当的定量分析。我们还发现，在使用 FAIMS Pro 接口时，最佳补偿电压还存在另一个“甜点区间”，即 -48 至 -58 V。在该条件下，噪声得以降低，而那些在不使用 FAIMS 时也能被鉴定到的蛋白质，其序列覆盖度并未受到负面影响。与此同时，总体蛋白质组覆盖度得到提升，因此，就我们的实验结果而言，对于样本量受限的样品，使用 FAIMS 显然具有优势。
我们进一步发现，定制化谱库以及经优化调整的隔离窗口大小，有助于最大化前体离子和蛋白质的鉴定数量。由此获得了令人惊讶的高鉴定数：从仅 250 pg 的 HeLa 样品中可鉴定接近 7,400 个蛋白质组，而从单个 A549 细胞中则可鉴定多达 5,200 个蛋白质组。允许进行匹配并未对 FDR 产生负面影响，并且使用 Spectronaut 18 的默认设置可确认其非常接近预期的 1%。
据作者所知，我们首次使用双蛋白质组混合物在单细胞水平评估了定量准确性和精密度。我们发现，定量表现出乎意料地良好，并且在 Orbitrap Astral MS 以 50 SPD 运行时，每个洗脱峰获得 5 个数据点似乎已足以成功区分蛋白质丰度的 2 倍变化。然而，样本内已定量蛋白质的倍数变化的变异系数（CV）会随着蛋白质丰度的降低而增加，在我们的蛋白质组混合物中，其范围从较低的 5% 到最低丰度蛋白质的 40% 不等。因此，单细胞样本内的相对丰度也是未来生物学研究中的一个重要考量，因为目前对细胞群体进行可靠聚类只能依赖单细胞中丰度较高的蛋白质。尽管存在这一局限性，Orbitrap Astral MS 在已定量蛋白质数量、灵敏度和定量准确性方面均明显优于 Orbitrap Exploris 480 MS，从而能够基于细胞大小和细胞周期阶段研究未经处理的培养细胞的异质性，如在 A549 细胞中所示。此外，我们观察到的 TE 样细胞与 naïve hPSC 细胞之间的明显分离，突显了该 SCP 工作流程在人体囊胚研究中的应用潜力。它有望显著促进对 TE 发育机制、囊胚形态调控以及高质量囊胚分子标志物鉴定的探索。最终，这些认识不仅有助于加深我们对人类囊胚发育的理解，还有可能提高 IVF 的成功率。
总之，我们确信，我们这一从样本制备到数据解读均经过优化和改进参数的综合性工作流程，是推动单细胞蛋白质组学在灵敏度、重现性和定量性能方面迈向更高水平的一项极具价值的贡献，并将有助于推动单细胞蛋白质组学领域从发展阶段过渡为生物学家工具箱中的一种技术。
细胞在 37 °C、5% CO 的湿润环境中培养
A549 和 HeLa 细胞的分离、裂解及消化在 384 孔板（Thermo Scientific™ Armadillo 45PCR Plate，384-well，#12657516）中使用 cellenONE® 机器人进行，具体方法如前所述。
为了将基于 proteoCHIP® 的样品制备方法用于基准测试研究，细胞的分离与制备完全按照制造商手册中的说明进行。芯片采用标准（非严格）清洗流程：在甲醇中超声处理 20 分钟，随后用 Milli-Q 水充分冲洗，并于通风橱中干燥。由 Cellenion 建立了一套严格清洗方案，且被视为公司机密。简而言之，使用 cellenONE® 机器人将 300 nL 母混合液（0.2% DDM、10 ng/μL Trypsin Gold、100 mM TEAB）分配至 LF48 proteoCHIP® 或 EVO96 proteoCHIP®（Cellenion，法国里昂）的每个孔中。LF48 芯片预先在每孔中加入 2 μL 十六烷油（H6703-100ML，Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）。在细胞分离过程中，proteoCHIP 冷却至 8°C，以使十六烷（LF48）凝固。随后按照上述方法分离细胞，并在 85% 相对湿度条件下逐步升温至最终 50°C，以进行裂解和酶解。通过 cellenONE® 持续补加水分，使样品保持水合状态并维持近似恒定体积。之后加入 3.5 μL 0.1% TFA，并将 proteoCHIP LF48 置于湿冰上冷却，使十六烷再次冻结，从而可通过手动方式将其与含样品的水相分离；随后将样品转移至低吸附 96 孔 PCR 板（EP0030129512，twin.tec. PCR Plate 96 LoBind，带裙边，Eppendorf，达姆施塔特）的各个孔中。EVO96 proteoCHIP 不含十六烷，因此可直接置于 96 孔 PCR 板上方，通过离心（500 g，30 秒）转移样品。
Naive PSCs 在明胶包被的培养板上、以经 γ 射线照射处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层进行培养。包被及饲养层制备的具体方法与先前报道的方法一致。
采用 Accutase（Biozym，B423201）在 37°C 下消化 5 分钟以解离 naive PSCs。随后使用移液器进行温和机械吹打解离，并经离心收集细胞沉淀。将沉淀重悬于 PXGL 培养基中，并补加 10 μM Y-27632（MedChemExpress，HY-10583）。为去除 MEFs，将细胞悬液转移至明胶包被的培养板上，并于 37°C 孵育 70 分钟。采用 Countess 自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific）结合台盼蓝染色进行细胞计数和活力检测。细胞以 1.2×10^5 个/孔的密度接种于 Geltrex（0.5 μl/cm^2）包被的 6 孔板中。培养在低氧培养箱中进行（5% CO2，5% O2）。在诱导第 0 天，将培养基更换为 PDA83 培养基，其组成为 N2B27 基础培养基、1 μM PD0325901、1 μM A83-01（MedChemExpress，HY-10432）和 2% FBS。第 1 天加入 2 μM XMU-MP-1。第 2 天和第 3 天，将培养基更换为含 2% FBS 的 N2B27。第 4 天，按照以下方案进行 FACS 分选。
TE样细胞和初始态PSC分别在37°C下使用Accutase消化10分钟和5分钟。随后使用移液器进行温和机械解离。之后，细胞分别用针对TROP2和SUSD2的抗体进行染色。对于TE样细胞分选，选择TROP2+细胞并分选至384孔板中，以确保排除未分化细胞。同样地，对于初始态hPSC分选，将SUSD2+细胞分选至384孔板中，以排除MEF。在这两种条件下，均使用DAPI染色识别并排除死细胞。
HeLa（H）（Thermo Scientific，Pierce™ HeLa Protein Digest Standard，88328）和酵母（Y）（Promega，MS Compatible Yeast Protein Extract，Digest，Saccharomyces cerevisiae，100ug，V7461）在0.1% TFA中按以下比例混合，终浓度为250 pg/μL：H:Y = 200 pg : 50 pg；240 pg : 10 pg；150 pg : 100 pg。取每种双蛋白质组混合物1 μL（=250 pg）进样，以评估超低输入水平下的定量下限。
HeLa（Thermo Scientific，Pierce™ HeLa Protein Digest Standard，88328）或K562（Promega，Mass Spec-Compatible Human Protein Extract，V6951）溶解于0.1% TFA、0.015% DDM（N-Dodecyl β-D-Maltosid，D4641-500MG，Sigma Aldrich，Germany）中，配制为5 ng/μL的浓度，用于注入LC-MS系统。
样品使用Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC系统（Thermo Scientific）进行分析。肽段在50°C下采用直接进样模式，使用Aurora Ultimate TS 25 cm纳流UHPLC色谱柱（带集成发射器；Ion Optics，Fitzroy，Australia）进行分离。
肽段分离在30–80 SPD条件下进行，具体细节见补充表1，所有单细胞测定均在50 SPD条件下完成。快速样品加载在最大压力1400 bar和最大流速1 μL/min条件下进行。
质谱测定中，Orbitrap Astral质谱仪或用于在Orbitrap Exploris 480质谱仪上进行基准测试的仪器（两者均为Thermo Scientific）与液相色谱联用。两台仪器均配备FAIMS Pro接口（Thermo Scientific）和EASY-Spray离子源。用于重复性检查的数据（补充图1）是在第二台配备FAIMS Pro Duo接口的Orbitrap Astral仪器上采集的。除非另有说明，补偿电压设定为-48（Orbitrap Astral）或-50（Orbitrap Exploris 480）。电离采用1.85 kV的电喷雾电压；对于老化的发射器，则相应提高至略高电压以确保喷雾稳定性。
在 Orbitrap Astral 质谱仪上，MS1 谱图使用 Orbitrap 分析器以 240k 分辨率在 m/z 400–900 范围内采集，AGC 目标设为 500%，最大离子注入时间为 100 ms。对于采用 Astral 分析器进行 DIA 模式下的 MS2 采集，选择了互不重叠的隔离窗口，窗口范围从 m/z 5（100 个细胞，10 ng）到 m/z 20（1–40 个细胞、空白样品、250 pg 总样），扫描范围为 m/z 400–800。前体离子累积时间范围为 10 ms（100×细胞，10 ng 总样）至 40 ms（250 pg 总样）再至 60 ms（1–40 个细胞、空白样品），AGC 目标设为 800%。
在 Orbitrap Exploris 480 质谱仪上，由于该仪器相较于 Orbitrap Astral 质谱仪速度和灵敏度较低，因此对 MS 方法进行了调整。然而，此前测试的高通量分析可比设置
所有原始数据均使用 Spectronaut（v 18.6.231227.55695，Biognosys AG）进行分析。
定量在 MS1 水平上进行。由于未进行烷基化步骤，因此在单细胞检索中移除了作为固定修饰的半胱氨酸氨甲酰甲基化。除此之外，所有分析及谱库构建均采用默认设置。检索针对人类蛋白质组进行（UniProt proteome UP000005640，reviewed，20408 个蛋白条目，下载于 4
对于 FDR 检查，使用 pyteomics 生成了诱饵数据库（“shuffled target”）。
使用原始定量数值。所有缺失定量值的蛋白质均被过滤去除。
对于含 hPSC 数据集的 A459 和 TE，分别过滤掉在超过 20 个细胞和 5 个细胞中存在缺失值的所有蛋白质。其余缺失值以数据集中最小值对应的强度进行填补。随后将定量数据转换为 log2 格式并归一化至正态分布。用于 PCA 和 UMAP 聚类的细胞直径数据取自 cellenONE 机器人。PCA 和 UMAP 聚类使用 sklearn 完成。
为寻找 hPSC 与 TE 细胞之间的统计学差异，采用了针对两个独立样本的 Student’s t 检验。使用 Benjamini-Hochberg FDR 对多重比较的 p 值进行校正。校正后 p 值的显著性水平设定为 0.05。将倍数变化（TE/hPSC）大于 1 的蛋白质视为上调蛋白。上调蛋白的 GO 分析使用 String-db.org 进行。
Wicell 细胞系 H9 根据协议 20-WO-341 用于一项题为“模拟人类早期发育：建立基于干细胞的人类囊胚三维体外模型（blastoids）”的研究项目。类囊胚的生成已获奥地利科学院科学伦理委员会批准。尽管就胚胎模型而言，ISSCR 指南并未禁止此类研究，但本研究未超过通常与受精后连续体外培养 14 天相对应的发育阶段。所有实验均遵守所有相关指南和法规，包括 2021 年 ISSCR 指南；该指南禁止将人类类囊胚移植入任何子宫。
JAB 和 MM 提出了研究构想，设计并实施实验，进行数据分析，并撰写了手稿。TNA、ED 和 BD 开展了实验并设计了实验方案。JS 和 HK 制备了 TE 和 hPSC。JS、HK、TMS 和 NR 对 TE 和 hPSC 数据进行了解释。PP 对数据分析策略作出了贡献。KM 和 MM 对本研究进行了监督。所有作者均对手稿进行了修订并同意其最终版本。
质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 提交至 ProteomeXchange Consortium。
TNA、ED 和 BD 为 Thermo Fisher Scientific 的员工，其他作者声明不存在竞争性经济利益。
本研究获得奥地利研究促进署（FFG）2022/01 第四轮基础设施资助（AT-SCP）以及维也纳科学技术基金（WWTF）项目 LS20-079 的支持。本研究还获得奥地利科学基金（FWF）的 P35045-B 项目（Grant-DOI 10.55776/P35045）和 F 8801-B 减数分裂项目（Grant-DOI 10.55776/F88）的资助。本研究全部或部分由奥地利科学基金（FWF）资助。JAB 的工作由 FWF 资助（Grant-DOI 10.55776/ESP497）。作者感谢 IMBA 的 Josef Penninger 研究团队提供 A549 细胞。为实现开放获取之目的，作者已对因本次投稿而产生的任何作者接受稿版本适用 CC BY 公共版权许可。
标题已更新，以提高准确性。 新增了附加图版和补充图，以提升手稿质量。
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🏷️ 单细胞蛋白质组学 质谱分析 DIA 定量蛋白质组学 细胞异质性