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OrthoFinder 的全对全 DIAMOND 步骤在深层分类分化条件下会系统性地漏检单拷贝直系同源群（single-copy orthogroups, SC OGs）：一个在严格限定的队列内能够被清晰回收的标记，当同一标记在门水平广泛范围的宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genome, MAG）集合中进行搜索时，往往会被丢弃，因为即使底层直系同源物确实存在，成对序列相似性也会低于 DIAMOND 的检测阈值。其结果是产生有偏的缺失——保留下来的超级矩阵倾向于包含接近该队列的基因组，却丢失同一门内更深层、分化更大的边缘基因组。 我们描述了一种两阶段的队列-HMM 招募流程（首先基于队列比对为每个 OG 构建 profile HMM，随后使用 hmmsearch 对更广泛的蛋白质组集合进行搜索），并在此基础上增加了一个独立的、针对每个 OG 的基因树质量控制（QC）步骤。该步骤根据每个招募命中相对于队列最近共同祖先（most recent common ancestor, MRCA）后代集合的位置进行分类，并在超级矩阵拼接之前施加一个按 MAG 计算的旁系同源率过滤器。我们在三个分类等级上对该流程进行了表征。在门水平（Omnitrophota，97 个队列 OG，714 个 NCBI MAG）上，该招募过程能够恢复那些原本会被仅基于 OrthoFinder 的超级矩阵所丢弃的 MAG，而 QC 则识别出 2 个深层外围 MAG——这些高度分化的基因组，其每个 OG 的末端在重复分析中虽然属于直系同源物，却持续落在队列 MRCA 后代集合之外——并由按 MAG 过滤步骤将其移除。在科水平（Pelagibacteraceae，146 个队列 OG，366 个 NCBI MAG）以及属水平（Actinomarina，289 个队列 OG，23 个 NCBI MAG）上，按末端统计的旁系同源候选率降至 0.0%。 该流程解决了两种彼此独立的失效模式。队列内旁系同源密度会破坏队列步骤中严格单拷贝 OG 的发现（即科水平情形，在该情形下，每一个候选标记至少在一个队列物种中具有多个拷贝；宽松的队列判据提供了标记集合，而 HMM 招募则判别每个 NCBI MAG 应贡献哪一个拷贝）。DIAMOND 覆盖范围衰减会破坏对分化程度最高的 NCBI MAG 的 OG 归属（即门水平情形，在该情形下，成对相似性低于 DIAMOND 的检测阈值；HMM 招募能够恢复这些缺失项，而每个 OG 的 QC 步骤则过滤残余的旁系同源候选）。在属水平上，这两种失效模式均不活跃，OrthoFinder 可直接胜任；HMM 招募虽被执行，但未发现新的直系同源物。代码及各案例的数据产物已作为社区资源发布于 Zenodo（DOI 10.5281/zenodo.20422348）。
OrthoFinder 的全对全 DIAMOND 步骤在深层分类分化情况下会系统性遗漏单拷贝直系同源组（single-copy orthogroups, SC OGs）：某个标记在一个定义严格的紧密队列内部可以被清晰恢复，但当针对门水平广覆盖的宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genome, MAG）集合搜索同一标记时，即使底层直系同源基因确实存在，由于成对序列相似性低于 DIAMOND 的检测阈值，该标记仍会被丢弃。其结果是产生有偏倚的缺失——保留下来的超级矩阵更倾向于包含接近该队列的基因组，而丢失来自同一门中更深层、分化更大的边缘区域的基因组。
我们描述了一种两阶段的队列-HMM 招募流程（首先基于队列比对为每个 OG 构建 profile HMM，然后使用 hmmsearch 针对更广泛的蛋白质组集合进行搜索），随后进行一个独立的、针对每个 OG 的基因树质量控制（QC）步骤：该步骤根据每个招募命中相对于队列最近共同祖先（most recent common ancestor, MRCA）后代集合的位置进行分类，并在超级矩阵拼接之前施加一个按 MAG 计算的旁系同源率过滤。我们在三个分类等级上对该流程进行了表征。在门水平（Omnitrophota，97 个队列 OG，714 个 NCBI MAG）上，该招募流程恢复了那些本会被仅依赖 OrthoFinder 的超级矩阵所丢弃的 MAG，而 QC 识别出 2 个深层边缘 MAG——这些高度分化的基因组，其逐 OG 末端在重复分析中尽管属于直系同源基因，却反复落在队列 MRCA 后代集合之外——并由按 MAG 的过滤步骤将其去除。在科水平（Pelagibacteraceae，146 个队列 OG，366 个 NCBI MAG）和属水平（Actinomarina，289 个队列 OG，23 个 NCBI MAG）上，按末端统计的旁系同源候选率降至 0.0%。
该流程解决了两种相互独立的失效模式。队列内旁系同源密度会在队列步骤中破坏严格 SC OG 发现（即科等级情形，其中每个候选标记至少在一个队列物种中具有多个拷贝；放宽的队列判据提供了标记集合，而 HMM 招募则判别每个 NCBI MAG 应贡献哪一个拷贝）。DIAMOND 覆盖范围衰减会破坏对分化程度最高的 NCBI MAG 的 OG 赋值（即门等级情形，其中成对相似性低于 DIAMOND 的检测阈值；HMM 招募恢复了这些缺失项，而逐 OG 的 QC 步骤过滤掉残余的旁系同源候选）。在属等级中，这两种模式均未激活，OrthoFinder 可直接满足需求；HMM 招募虽然运行，但未发现新的直系同源基因。
代码及各案例的数据产物已作为社区资源发布于 Zenodo（DOI 10.5281/zenodo.20422348）。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.27.728348v1?rss=1
🏷️ 系统发育基因组学 隐马尔可夫模型 直系同源群 超级矩阵 宏基因组组装基因组 基因树质量控制