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遗传载荷的高效且靶向递送仍然是基因与细胞治疗领域的主要障碍，尤其是在本征上对病毒转导具有抗性的原代人T细胞中。腺相关病毒（AAV）是应用广泛的载体，但其受到免疫中和、对某些细胞类型转导效率低以及缺乏靶向特异性等限制。在此，我们提出NEO-AAV，这是一种经工程化设计的三组分融合蛋白（PH-ALG2-PKD12），旨在将组装完成的AAV衣壳募集进入内源性细胞外囊泡（EV）中。该设计将PI(4,5)P2导向的膜靶向、多价PKD12（源自AAV受体的PKD1-PKD2串联结构域）介导的衣壳聚集，以及ALG2介导的内体分选复合体运输所需（ESCRT）机器募集相结合，从而将AAV生物发生过程重定向至囊泡介导的释放途径，生成EV包裹的病毒颗粒；与被动释放的EV-AAV对照相比，其囊泡装载效率得到提升。 在中和实验中，NEO-AAV对单克隆抗AAV6中和抗体（ADK6）表现出增强的耐受性，在所有测试抗体浓度下均保持了转导活性；而这些浓度能够完全中和裸露AAV6，且NEO-AAV的屏蔽能力超过了被动形成的EV-AAV6。通过表面展示CD7/CD3/CD28三重嵌合体，NEO-AAV6能够以单一步骤同时激活并转导原代人T细胞，在CD7+淋巴细胞中实现约40%的eGFP+细胞比例，而无需额外的基于微珠的预激活步骤。作为代表性应用，我们证明NEO-AAV能够支持从原代人外周血单个核细胞（PBMC）生成具有功能的CAR-T细胞，所得CAR-T细胞对CD19+ Nalm6靶细胞表现出抗原特异性的IFN-γ释放和细胞毒性。与AAV附加体表达一致，CAR表达在第5天附近达到峰值，并在第15天前下降，这表明NEO-AAV应被视为一种激活偶联的递送模块，而非独立的持久工程化解决方案。 综上，这些发现将NEO-AAV确立为一种概念验证性的工程化分泌途径，用于生成EV包裹的AAV，其不仅改善了免疫屏蔽能力，还能够在原代人PBMC中实现对表达CD7的淋巴细胞的单步、激活偶联转导，从而为免疫细胞工程流程提供了一个基础构件，并具有应用于体内环境的潜力。
NEO-AAV：一种用于激活偶联型 T 细胞转导和 CAR-T 细胞生成的工程化细胞外囊泡包裹 AAV 平台 | bioRxiv
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NEO-AAV：一种用于激活偶联型 T 细胞转导和 CAR-T 细胞生成的工程化细胞外囊泡包裹 AAV 平台
Zhiyong Lei， Songpu Xie， Qiangbing Yang， Lisa V. Jansen， Bing Yao， Geng Yang， Kaiyong Qu， Pieter Vader， Christian Snijders Blok， Saskia C.A. Jager， Gerard J.J. Boink， Raymond M. Schiffelers， Pieter A.F. Doevendans， Junjie Xiao， Joost P.G. Sluijter
doi： https://doi.org/10.64898/2026.05.27.727849
Zhiyong Lei 1 乌得勒支大学医学中心； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在持有人为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。
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发表于 2026 年 5 月 29 日。
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Zhiyong Lei， Songpu Xie， Qiangbing Yang， Lisa V. Jansen， Bing Yao， Geng Yang， Kaiyong Qu， Pieter Vader， Christian Snijders Blok， Saskia C.A. Jager， Gerard J.J. Boink， Raymond M. Schiffelers， Pieter A.F. Doevendans， Junjie Xiao， Joost P.G. Sluijter
bioRxiv 2026.05.27.727849； doi： https://doi.org/10.64898/2026.05.27.727849
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NEO-AAV：一种用于激活偶联型 T 细胞转导和 CAR-T 细胞生成的工程化细胞外囊泡包裹 AAV 平台
Zhiyong Lei， Songpu Xie， Qiangbing Yang， Lisa V. Jansen， Bing Yao， Geng Yang， Kaiyong Qu， Pieter Vader， Christian Snijders Blok， Saskia C.A. Jager， Gerard J.J. Boink， Raymond M. Schiffelers， Pieter A.F. Doevendans， Junjie Xiao， Joost P.G. Sluijter
bioRxiv 2026.05.27.727849； doi： https://doi.org/10.64898/2026.05.27.727849
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.27.727849v1?rss=1
🏷️ AAV递送 细胞外囊泡 T细胞转导 CAR-T细胞 免疫屏蔽 基因治疗