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RNA 分子之间以及与其结合的蛋白质之间的物理邻近性，是大量转录后调控的基础；然而，将这些关系转换为序列信息的方法往往需要付出代价。现有的 RNA-RNA 相互作用图谱技术依赖于交联、片段化和/或邻近连接，因此每个互作伙伴最终仅以短的嵌合读段形式保留下来，其完整身份和序列均无法得到保留。 我们描述了 PAIR-link（Priming Annealed Isothermal RNA linking）方法，这是一种无需连接且无需片段化的策略，可将两条分别转录的 RNA 连接为一条连续的 cDNA，同时保留双方的序列。两条经工程化改造的 RNA 在其 3' 末端携带互补尾序列。这些尾序列相互退火并彼此引发，一种 Bst 家族的等温逆转录酶沿连接位点向两个方向延伸，从而将两条 RNA 同时复制为一条嵌合 cDNA，随后可通过 PCR 扩增并直接进行桑格测序读取。 我们首先使用人工合成的寡核苷酸在体外建立了该反应体系。由于该反应需要明确界定的 3' 末端，我们使用 RNA 聚合酶 III 启动子驱动条形码 RNA 的转录，其转录产物在确定位置终止，而不是采用具有 poly(A) 尾的 RNA 聚合酶 II 转录产物。 随后，我们在人细胞中将 PAIR-link 实现为一种重构的核糖核蛋白体系，其中每条条形码 RNA 均被系链到分体报告蛋白的一半（split-cpHaloTag 或 split-TurboID）上，因此分体蛋白的重构可使两条 RNA 相互靠近并促进连接。在珠子完整保留的 pull-down 过程中，该复合物可在逆转录和扩增步骤中保持稳定。对于分别被独立导向细胞核和细胞质的报告体系，我们均回收到了符合预期且经序列验证的嵌合产物，表明该方法可在不同的亚细胞环境中发挥作用。 据我们所知，PAIR-link 是首个能够在不依赖交联、片段化或连接的情况下，将两条分别产生的 RNA 融合为单一嵌合 cDNA 分子、并保留 RNA 全长序列的方法。我们讨论了该方法当前的适用范围——目前其仍限于具有明确 3' 末端的 RNA——并概述了未来将其扩展至天然转录本和蛋白质相互作用图谱绘制的可能路径。
RNA 分子之间以及与其结合的蛋白质之间的物理邻近性，构成了大量转录后调控的基础；然而，将这些关系转化为序列信息的方法往往需要付出代价。现有的 RNA–RNA 相互作用图谱技术依赖于交联、片段化和/或邻近连接，因此每个相互作用伙伴最终仅以短的嵌合读段形式保留下来，无法保留其完整身份和全长序列信息。
我们描述了 PAIR-link（Priming Annealed Isothermal RNA linking）方法，这是一种无需连接且无需片段化的策略，可将两条分别转录的 RNA 连接为一条连续的 cDNA，同时保留两个相互作用伙伴的序列。两条工程化 RNA 在其 3' 端携带互补尾序列。这些尾序列彼此退火并相互引发，随后一种 Bst 家族等温逆转录酶沿连接位点双向延伸，将两条 RNA 一并复制为一条嵌合 cDNA，该 cDNA 可通过 PCR 扩增并直接进行 Sanger 测序读取。
我们首先使用合成寡核苷酸在体外建立了该反应体系。由于该反应需要明确界定的 3' 端，我们采用 RNA 聚合酶 III 启动子驱动条形码 RNA 的表达，因为其转录产物在确定位置终止，而不是采用经多聚腺苷酸化的 RNA 聚合酶 II 转录产物。
随后，我们在人细胞中将 PAIR-link 实现为一种重构的核糖核蛋白复合体，其中每条条形码 RNA 均锚定于裂分报告蛋白的一半（split-cpHaloTag 或 split-TurboID），从而使裂分蛋白的重构能够将两条 RNA 拉近，并促进其连接。珠子完整状态下的 pull-down 可在逆转录和扩增过程中保持该复合体的完整性。对于分别独立导向细胞核和细胞质的报告系统，我们均获得了符合预期且经序列验证的嵌合产物，表明该方法可在不同的亚细胞环境中发挥作用。
据我们所知，PAIR-link 是首个在不依赖交联、片段化或连接的条件下，将两条分别产生的 RNA 融合为单一嵌合 cDNA 分子、并保留两条 RNA 完整序列的方法。我们讨论了该方法当前的适用范围——目前仍限于具有明确 3' 端的 RNA——并概述了其未来拓展至天然转录本及蛋白质相互作用图谱绘制的可能路径。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.29.728768v1?rss=1
🏷️ RNA-RNA相互作用 嵌合cDNA 逆转录 等温扩增 RNA工程 转录后调控