- 2 次围观
在小鼠胚胎发生过程中，上胚层与胚外内胚层之间的相互作用对于胚层命运决定和体轴发育至关重要。类原肠胚在缺乏来自胚外环境形态发生信号的情况下，能够重现原肠胚形成的某些方面。这导致其主要表现为后部化和背侧化表型，对胚胎谱系的代表性较为有限。本文中，我们开发并采用了一种共聚集（aggregoid）方法，将胚胎样细胞与胚外内胚层样细胞结合，以模拟发育中小鼠胚胎中的空间相互作用。所得胚胎模型显示出结和脊索的出现、富集的内胚层细胞群，以及增强的中胚层多样性，包括心咽谱系和血管内皮，并总体呈现前部化和腹侧化表型。该研究阐明了一种灵活的策略，用于优化基于干细胞的胚胎模型，以获得特定的形态类型。
小鼠三维类原肠胚是基于干细胞的胚胎模型（SCBEMs）的一个子类，能够重现胚胎发育的关键特征：体轴的建立、三胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的出现，以及早期器官发生的启动。
与胚外内胚层（ExEnd）相对应的细胞类型，如原始内胚层（PrE）、脏壁内胚层（VE）和壁内胚层（PE），在小鼠早期胚胎发生中发挥多层面且动态的作用，它们支持上胚层成熟和体轴形成，同时提供结构支撑和营养运输。
本文提出了一种灵活且模块化的共聚集策略，以提升SCBEM的复杂性，并阐明ExEnd对谱系决定、模式形成和形态发生的影响。我们开发了一个共聚集平台，将预先分化的ExEnd样细胞类型（PrE样、VE样和AVE样）与幼稚态小鼠胚胎干细胞（mESCs）结合。我们发现，ExEnd细胞的存在能够有利地调节NODAL和WNT信号传导的平衡，从而增强细胞多样性和结构形成。与经典类原肠胚相比，所得aggregoid表现出原条、脊索样结构以及总体增强的谱系代表性等特征，包括内胚层谱系、轴向中胚层和心咽中胚层，并显著增加腹侧和前侧细胞类型。此外，我们证明，特异性引入PrE样、VE样或AVE样细胞能够对谱系组成进行精细调控。总体而言，aggregoid策略的可重复性和灵活性使其成为一个可用于工程化调控mSCBEM组成及其发育潜能的平台。
为了生成包含胚外内胚层（ExEnd）区室的小鼠SCBEM，我们采用并调整了多种方案，以在不诱导转基因过表达的情况下，由mESCs衍生出类似着床前和着床后ExEnd的细胞类型。先前的研究
Bulk RNA测序（RNA-Seq）表明，2i mESCs 具有初始型多能性（naïve pluripotency）的形态学和转录特征，包括集落呈圆顶状形态以及……的表达
向VE样和AVE样细胞分化伴随着形态学变化：在NACLB处理开始后不久，细胞质中出现脂滴，以及XAL细胞中出现特征性的形态改变，包括柱状细胞和具有迁移表型的细胞（
为研究ExEnd样细胞对小鼠SCBEMs早期图式形成的影响，我们将2i细胞与三种预分化ExEnd样细胞群中的任意一种在96孔U形底板中进行共聚集（
在CHIR脉冲处理之前，即聚集后48小时，在ExEnd聚集体和对照gastruloids中均检测不到BRA-GFP表达（
至72小时，对照gastruloids中的BRA-GFP表达呈现径向对称分布模式（
在72小时时间点，scRNA-seq显示，在对照gastruloids中，仅有54%的细胞表达……
scRNA-seq数据进一步显示，在72小时，对照以及RACL-、NACLB-和XAL-aggregoids中最主要的细胞类型均为尾侧上胚层（caudal epiblast, CE）（
RACL-、NACLB-和XAL-aggregoids中PS样和前部APS样转录程序的激活，并最终导致后部与前部细胞类型的共同出现，这一点还得到TGF-β相关基因上调的进一步支持，例如……
从72到96小时，对照gastruloids显示出BRA-GFP结构域的逐步极化，其表达逐渐局限于后半部，并随后随着伸长过程定位于后端尖部（
在72小时，CE簇中记录到BRA的高表达，其特征为表达……
接下来，我们对活体样本进行实时成像，并对固定样本进行免疫染色，以在空间上定位所鉴定的细胞群体。在96小时，BRA表达沿中线聚集，而在侧方区域缺失（
在96小时，部分RACL-和NACLB-aggregoids显示出一个明确的BRA、CDH1和FOXJ1（结节标志物）表达结构域，该结构域被广泛的SOX17阳性区域（类似内胚层）以及表达FOXF1和BRA的中胚层细胞所包围（
结节（node）是轴向中胚层（脊索和前脊索板）的来源及其诱导性生态位。
通过表达诸如Sonic hedgehog之类的形态发生素
总之，我们的数据表明，通过诱导aggregoid中APS样命运的出现，ExEnd样细胞启动了一系列发育过程，最终导致结节样和脊索样细胞的形成。
来源于FLK1（KDR）-GFP报告基因系的对照gastruloids
在96小时，对照gastruloids通常包含神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitors, NMPs），这是一类共表达……的双能细胞群体
中胚层谱系的多样性在不同条件下存在显著差异。在对照组 gastruloids 中，中胚层群体主要由轴旁中胚层衍生物构成（补充材料 7e, f）。相比之下，ExEnd-aggregoids 显示出更广泛的中胚层谱系谱，包括 IM 表征增加，以及对应于侧板中胚层（LPM）和轴性中胚层（脊索）的细胞类型出现，表明中胚层多样性增加（补充材料 4b-d, 7e, f）。
scRNA-seq 进一步鉴定出一个对应于心咽中胚层的独特细胞簇（补充材料 4b-d）。该细胞簇表达关键的心脏谱系基因，例如
这些结果表明，添加 ExEnd-like 细胞增强了 LPM 的发育，并在缺乏外源性心脏诱导刺激的情况下，显著促进了 ExEnd-aggregoids 中心血管转录程序的出现。
在小鼠胚胎中，内胚层来源于两种不同的起源：一种是植入前阶段即已指定的早期胚外内胚层，称为原始内胚层（PrE）；另一种是发育于原肠胚形成期间、来源于 APS 的确定性内胚层（DE）。
在 scRNA-seq 数据集中，我们在 RACL-、NACLB- 和 XAL-aggregoids 中检测到了胚外内胚层细胞簇，在 48 至 120 小时的所有时间点均可见，但在对照 gastruloids 中未检测到（
通常认为，gastruloids 形成 DE 的能力是有限且可变的，并且这种能力会因细胞系和培养条件的不同而表现出显著变异。
为研究 ExEnd-like 细胞对 DE 形成的其他影响，我们选用了 BRA-GFP;SOX17-RFP mESC 细胞系，因为其在经典 gastruloids 中具有较强的内胚层生成能力。尽管在 120 小时的对照 gastruloids 中存在大量 SOX17 阳性细胞，确定性内胚层（DE）大多未能组织成连续的上皮管。相反，内胚层区室由一个较大的、位于后部且邻近 BRA 的区域构成。
采用 BFP-ROSA26;FLK1-GFP 双报告基因细胞系作为 RACL 细胞，并以 BRA-GFP;SOX17-RFP 双报告基因细胞系作为 2i 细胞，对 72 至 120 小时进行比较性活细胞成像，揭示了 DE 动态过程中的差异。在对照 gastruloids 中，SOX17-RFP 表达通常在 88–96 小时之间启动，出现在聚集体内部较深处、邻近后部 BRA-GFP 区域的位置，并逐渐向前延伸（
我们的数据表明，当 ExEnd-like 细胞与 2i 细胞共同聚集时，能够积极影响内胚层形成，产生来源于 2i 的结构，并表现出确定性内胚层特化的特征。
Gastruloid 是一种胚胎发育的三维模型，通过聚集多能干细胞并施加 CHIR 脉冲生成，以在缺乏传统上被认为对胚胎中这些发育过程至关重要的胚外结构的情况下，模拟原肠胚形成这一复杂过程的关键特征，如对称性破缺、图案形成和谱系分离。Gastruloid 兼具可重复性与模块化特性，因此非常适合用于有针对性地测试天然胚胎中特定特征对胚胎发育的影响。
在本研究中，我们测试了三种来源于 2i mESCs 的不同胚外内胚层样细胞群，作为上述所用 XEN 细胞的替代。为此，我们采用了已发表的、基于调控 WNT、Nodal 和 JAK/STAT3 信号通路的分化方案。
与 XEG 相比，ExEnd-aggregoid 并未表现出显著的神经上皮表型。尽管 RACL、NACLB 和 XAL 细胞表达层粘连蛋白，但其内源性水平似乎不足以重现 XEG 模型中所观察到的细胞外基质（ECM）效应。因此，尽管在 ExEnd-aggregoid 中出现了体节中胚层和类神经管细胞群，
在 aggregoid 中整合 ExEnd 样细胞可有效促进早期前后轴（AP）模式化，导致早在 72 小时时即出现不对称的 BRA 表达。从一开始，BRA 表达即局限于后极，从而建立了一个界限清晰的 BRA 阴性前部区域。与 XEG 不同，该 BRA 阴性区域并不局限于毗邻胚外区室的一条狭窄条带，而是延伸覆盖了约二分之一至三分之一的 ExEnd-aggregoid，表明前部区域发生了扩展。值得注意的是，BRA 的受限表达并未导致 SOX2 阳性前部神经结构的出现；相反，该区域呈现出 EOMES 阳性的前部原条样特征。在 84–96 小时期间，这一区域内又出现了一个额外的前部 BRA 表达域，提示其发生了动态重组，并可能存在类似于早期中内胚层形成的前部原条活动。这可能表明，ExEnd 样细胞不仅在前部神经外胚层形成中发挥作用，还参与原条的构建，并促进 ExEnd-aggregoid 内细胞谱系的多样性，这一点也得到了 scRNA-seq 分析的支持。
在本研究中，我们表明，与 ExEnd 样细胞共聚集会使 NMP 命运向促中胚层偏向转变，并导致中胚层细胞类型总体占优势。这可以通过 ExEnd 样细胞中表达的 BMP（2/5/6/7）的促中胚层效应来解释。
ExEnd-aggregoid 还表现出 Nodal 及其相关基因的上调，以及前部原条样结构、结样结构及其衍生物的出现；这些结构的特化依赖于 Nodal，例如脊索、前部中胚层和确定性内胚层。这种展开方式与近期研究结果一致，由
尽管具有良好的可重复性和广泛的适用性，常规 gastruloid 普遍呈现后部化身份，以及内胚层、轴向中胚层和心血管衍生物代表性不足，仍然是其主要局限性，这限制了其发育潜能以及其在研究胚胎发育某些方面时的适用性。其中部分谱系可通过添加外源性生长因子得到部分恢复——例如，在心脏发生条件下
本研究使用了以下小鼠胚胎干细胞（mESC）系：R1（SCRC-1011，ATCC）、Flk1-eGFP（Jakobsson et al., 2010）、Rosa26-BFP/Flk1-GFP（未发表；由 Anna Bigas 实验室提供）以及 Bra-GFP/Sox17-RFP（Pour et al., 2022）。mESC 在覆盖有 0.1% 明胶溶液（ES-006-B，Merck）的 6 孔培养板上，使用 serum + LIF 培养基进行培养。该培养基由 KnockOut DMEM（10829018，Gibco）补充 15% 胎牛血清（FBS；10309433，HyClone）、非必需氨基酸（NEAA；11140050，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、0.1 mM β-巯基乙醇（M3148，Merck）以及小鼠白血病抑制因子（LIF；ESG1107，Merck）组成。
对于 naïve 状态转换，将 mESC 接种于包被 0.01% 鸟氨酸（P3655，Merck）的孔中，并在 2i/N2B27+LIF 培养基中培养。2i/N2B27+LIF 的组成如下：DMEM/F12（11330032 或 11039021，Gibco）与 Neurobasal 培养基（21103049 或 12348017，Gibco）按 1:1 混合，并补充 N2（17502048，Gibco）、B27（17504044，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、NEAA（11140050，Gibco）、丙酮酸钠（11360039，Gibco）、β-巯基乙醇（M3148，Merck）、牛血清白蛋白（BSA；A8412，Merck）、LIF（ESG1107，Merck）、CHIR99021（3 µM；4423，Tocris）和 PD0325901（1 µM；4192，Tocris）。在进行后续应用之前，细胞在 naïve 条件下维持 5–7 天。
所有细胞培养均在 37 °C、100% 湿度和 5% CO₂ 条件下进行。
在2i/N2B27+LIF培养基中培养5–7天的小鼠胚胎干细胞（mESCs）使用Accutase（A6964，Merck）或TrypLE Express（12604013，Gibco）消化收集后，以1×10⁵ cells/cm²的密度重新接种于铺有0.1%明胶的6孔板上。细胞接种于补充1×B-27 Supplement Minus Insulin（A1895601，Gibco）的RPMI 1640培养基（11875093，Gibco）中。最初24小时后，将培养基更换为RACL培养基，其组成包括RPMI 1640（11875093，Gibco）、1×B-27 Supplement Minus Insulin（A1895601，Gibco）、100 ng/mL Activin A（Peprotech，120-14P）、3 μM CHIR99021（4423，Tocris Bioscience）以及小鼠LIF（ESG1107，Merck）。在该方案的第3至第4天之间对培养物传代一次。在RACL处理的第6–8天，细胞要么在RACL条件下用于共聚集实验，要么进入进一步分化方案。
为启动进一步分化，将RACL培养基更换为NACL培养基24小时。NACL培养基由N2B27基础培养基组成，后者由DMEM/F12（11320033，Gibco）与Neurobasal培养基（21103049，Gibco）按1:1混合配制，并补充N2 Supplement（17502048，Gibco）、B-27 Supplement（17504044，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、非必需氨基酸（11140050，Gibco）、丙酮酸钠（11360039，Gibco）、β-巯基乙醇（M3148，Merck）和BSA（A8412，Merck），同时再补充100 ng/mL Activin A（Peprotech，120-14P）、3 μM CHIR99021（4423，Tocris Bioscience）以及小鼠LIF（ESG1107，Merck）。
为分化为内脏内胚层样（VE-like）细胞，在NACL培养基中进一步补充50 ng/mL重组小鼠BMP4（Peprotech，315-27），称为NACL+B。为生成前部内脏内胚层样（AVE-like）细胞，先前维持于NACL中的细胞接受XAL培养基处理，该培养基由10 μM XAV939（S1180，Selleck Chemicals）、100 ng/mL Activin A（120-14P，Peprotech）和小鼠LIF（ESG1107，Merck）组成。NACL+B和XAL两种处理均持续三天。
类原肠胚按照既往建立的方案生成。
为生成aggregoid，在聚集步骤中将300个初始态mESCs与100个额外细胞（RACL、NACL+B或XAL条件所得）混合。细胞混合物在与上述类原肠胚形成相同的条件下接种。所有后续步骤，包括CHIR99021处理和每日更换培养基，均按照标准类原肠胚方案进行。对于“Minus Chir”实验，在48小时向孔中加入Ndiff 227（Takara，Y40002）或自制N2B27。
总RNA使用RNeasy Micro Kit（Qiagen，74004）按照制造商说明，从细胞培养物或合并收集的类原肠胚中提取。每次提取收集48–96个类原肠胚或300,000–1,000,000个细胞，并在处理前储存于–80 °C。RNA浓度使用Nanodrop分光光度计（ThermoFisher Scientific）进行定量。
采用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ThermoFisher Scientific，4368814）合成互补 DNA（cDNA）。定量实时 PCR（RT-qPCR）使用 ViiA 7 热循环仪（ThermoFisher Scientific），并配合 TaqMan Gene Expression Master Mix 及基因特异性 TaqMan 探针（ThermoFisher Scientific）进行。引物详细信息见表 X。
每个 qPCR 反应包含 1 μL cDNA（稀释至 20 ng/μL），总体积为 10 μL，在 386 孔板（Applied Biosystems，4309849）中进行。基因表达水平以管家基因 Gapdh（探针 ID：Mm01180221_g1，ThermoFisher Scientific，4331182）进行标准化，相对表达量采用 2^–ΔΔCT 方法计算。技术重复数为 3，生物学重复数至少为 3。采用 2i/N2B27 细胞作为标准化的参考样本。
总 RNA 共提取自 12 个小鼠细胞样本：2i/N2B27 条件下的 naive mESCs，以及分化的胚外内胚层样细胞类型：RACL、NACLB 和 XAL。取 2 μg 总 RNA，溶于 100 μL 无 RNA 酶水中，用于文库制备。RNA 质量采用 Agilent Bioanalyzer 评估。RNA-seq 文库采用链特异性、poly(A) 富集方案进行制备，使用 TruSeq Stranded mRNA Library Prep（20020595，Illumina）和接头 TruSeq RNA UD Indexes（货号 2002237，Illumina）。测序在 Illumina NovaSeq X Plus 系统上使用 1.5B flow cells 进行，生成双端 150 bp 读长。文库经多重混样后在两个 lane 上测序，并在后续分析前合并来自两个 lane 的 FASTQ 文件。测序仪器及软件包括：NovaSeqXPlus System Suite v1.2.2.48004、BCL Convert v4.1.23、NSC scripts v1.0。
使用 BBDuk（BBMap toolkit）去除/修剪低质量 reads、接头序列以及作为测序 spike-in 使用的 PhiX（10_bbduk 文件夹）。清洁并去除接头后的 reads 使用 hisat2 比对至人类基因组/转录组（20_hisat2 文件夹）。使用 FeatureCounts 统计比对到基因上的 reads 数量（30_featureCounts 文件夹）。修剪后的 reads 使用 HiSat2 v2.1.0 比对至小鼠基因组，并使用 RNA-strandness RF 参数以适配链特异性文库制备。参考基因组和注释文件来自 Ensembl release 113：基因组 FASTA：Mus_musculus.GRCm39.dna.toplevel.fa；基因注释 GTF：Mus_musculus.GRCm39.113.gtf。比对后的文件使用 Samtools v1.2（配合 HTSlib v1.2.1）进行排序和建立索引。基因水平定量采用 FeatureCounts v1.4.6-p1，并使用以下参数：FeatureCounts 输出文件整理于 30_featureCounts 文件夹中，相关支持脚本和日志文件存储于对应的 *.sh 和 *.log 文件中。
来自 featureCounts 输出的基因计数被导入 R（v4.5.1）并在所有样本间进行合并。首先进行了初步质量检查，以识别任何技术性离群值或异常情况。随后，过滤掉在所有样本中总计数少于 50 的基因，并确保这些基因至少在 8 个样本中的 2 个样本中表达。经质量控制后的计数矩阵使用 DESeqDataSetFromMatrix 函数导入 DESeq2（v1.48.1）。随后，我们应用方差稳定化转换（Variance Stabilizing Transformation, VST）对计数进行标准化，用于主成分分析（PCA）和层次聚类，并识别主要基因。在所有条件组合之间鉴定差异表达基因；例如，2i vs RACL、2i vs NACL 等。针对每一组比较生成了火山图和 MA 图。随后，我们使用 clusterProfiler（v4.16.0）对上调和下调基因进行了基因过度富集分析和通路分析。
对应于四种条件的 gastruloids——标准 gastruloid、RACL-aggregoids、NACLB-aggregoids、XAL-aggregoids——分别在 48 h、72 h、96 h 和 120 h 收集。对于每种条件：在 48 h 汇集 384 个 gastruloids，在 72 h 汇集 288 个 gastruloids，在 96 h 汇集 192 个 gastruloids，在 120 h 汇集 96 个 gastruloids。为制备单细胞悬液，按照已发表方案（Bolondi et al., 2021）并结合我们的修改对 gastruloids 进行解离。将样本收集后转移至含有 200 µl TrypLE（12604013，Gibco）的培养皿中，于 37°C 孵育，并每 5 min 吹打一次，直至完全解离为单细胞悬液。随后，使用 800 µl 冰冷的 PBS + 0.5% BSA（A8412，Merck）终止 TrypLE 反应。经细胞过滤器（27215，Stemcell Technologies）过滤后，将细胞悬液于 4°C、300 rcf 离心 5 min。弃去上清后，用 1 ml PBS + 0.04% BSA 重悬细胞沉淀，并于 4°C、300 rcf 离心 5 min。重复清洗一次，最后将细胞沉淀重悬于 1 ml PBS + 0.04% BSA 中。通过台盼蓝染色评估细胞活性。所有时期和条件下的死亡细胞比例均低于 5%。随后，使用 Chromium Next GEM Single Cell Fixed RNA Sample Preparation Kit, 16 rxns（1000414；10X Genomics）对细胞悬液进行固定，并在文库制备前储存于 -80°C 或 +4°C。固定和清洗后细胞数不少于 300,000 的样本用于文库构建。
样本进行了多重混样，并按照 Chromium Fixed RNA Kit（10x-1000496，10X Genomics）用户指南，从每个样本 10,000 个细胞构建 cDNA 文库。测序前，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）配合 Agilent BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit 对 cDNA 文库进行质量控制和浓度测定。单细胞 RNA 测序在 Norwegian Sequencing Centre 使用 NovaSeq 1 平台、1 个 lane、25B、300 cycles 完成。
测序数据采用 10x Genomic Cell Ranger（v8.0.1）流程比对至小鼠 mm10 参考基因组，并据此在计算机中对样本进行拆分。随后，样本在同一流程中进行聚合，未进行标准化和批次校正；在适用情况下，也使用未聚合的数据。
由 CellRanger 流程（v8.0.1）生成的细胞条形码矩阵使用 Seurat 软件包（v5.3.0）载入 R（v4.5.1）中。第一轮质量控制要求细胞至少具有 200 个特征且不超过 7500 个，UMI 计数介于 400 至 40000 之间。线粒体基因含量阈值设定为低于 25%。该线粒体基因含量截断值通过数据驱动的方法确定。随后，运行一个基础的 Seurat 分析流程以识别聚类，主要依据 UMI 数量和特征计数。接着进行第二轮质量控制，移除主要由低 UMI/特征计数驱动的聚类。我们使用 Seurat 的 FindMarker 函数验证，被移除的低 UMI/特征计数聚类仅由低计数所致，而非由具有生物学意义的信号驱动。随后，使用 scDblFinder（v1.22.0）对细胞进行双细胞评分。scDblFinder_score > 0.7 的细胞被排除在后续分析之外。
经质量控制后的细胞基于条件（所用培养基）和时间，采用 Seurat 基于 RPCA 的整合方法进行整合。该过程中使用了 5000 个整合特征。通过从 Mouse gastruloid reference atlas 转移标签对细胞进行注释。部分细胞类型被合并为标准标签，以反映其生物学类型。
采用 EVOS M7000（Thermo Fisher Scientific）、IncuCyte S3（Sartorius）和 Nikon Crest Spinning disk（X-light V3 CREST）对细胞培养物和带有荧光报告基因的 gastruloids 进行自动活细胞成像。使用配备 Zyla sCMOS 相机、25 微米针孔盘以及 Nikon 20X/0.70 或 10X/0.40 空气物镜的 Andor Dragonfly Spinning Disk 共聚焦显微镜（Dragonfly）采集 gastruloids 和 RACL-aggregoids 的延时图像。图像每 15 分钟采集一次，总时长为 24 小时。显微镜配备了 Okolab 的环境控制舱，可维持 5% CO₂。
类原肠胚和细胞培养物在室温振荡平台上用4% PFA固定1小时，随后用PBS清洗3次，并储存在+4°C的PBS中。进行免疫染色时，样本首先在封闭液中孵育：PBS（14190，Gibco）、10% BSA（422361V，VWR Life Science）、0.5% Triton x-100（M143，VWR Life Science）、0.02% SDS（L3771，Sigma），于室温下孵育1小时，随后与用封闭液稀释的一抗在+4°C孵育过夜。经一抗孵育后，类原肠胚在室温下用封闭液清洗3次，每次30分钟，然后与用封闭液稀释的二抗在室温下孵育3小时。经二抗孵育后，类原肠胚再用封闭液清洗3次，每次30分钟。所使用的一抗如下：小鼠抗-DKK1（1:100，Santa Cruz，sc-374574）、山羊抗-Brachyury（1:200，R&D Systems，AF2085）、大鼠抗-Eomesodermin（1:100，ThermoFisher，14-4875-82）、兔抗-FoxJ1（1:200，Abcam，ab235445）、小鼠抗-Dab2（1:200，Santa Cruz，sc-136964）、兔抗-FoxF1（1:200，Abcam，ab308633）、兔抗-FoxA2（1:200，Merck-Millipore，07-633）、兔抗-Otx2（1:200，ThermoFisher，13497-1-AP）、小鼠抗-Sox2（1:200，R&D Systems，MAB2018）、兔抗-FoxC1（1:200，Abcam，ab223850）、小鼠抗-心肌肌钙蛋白T（1:200，ThermoFisher，MA5-12960）、小鼠抗-Tuj1（1:200，Abcam，ab78078）、山羊抗-E-cadherin（1:200，R&D Systems，AF748）、大鼠抗-PDGFRα（1:200，ThermoFisher，14-1401-82）、小鼠抗-GATA4（1:200，Santa Cruz，sc-25310）、兔抗-HNF4α（1:200，ThermoFisher，MA5-32295）、兔抗-Lefty（1:100，ThermoFisher，BS-11236R）。细胞膜染色采用Wheat Germ Agglutinin（WGA）Alexa Fluor 647偶联物（1:250，ThermoFisher，W32466）。肌动蛋白染色采用Phalloidin Alexa Fluor 488偶联物（1:200，ThermoFisher，A12379）。
所使用的二抗如下：驴抗兔Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，711-165-152）、驴抗兔AlexaFluor 647（1:500，Jackson ImmunoResearch，711-605-152）、驴抗小鼠Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-165-150）、驴抗小鼠AlexaFluor 488（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-545-150）、驴抗小鼠AlexaFluor 647（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-605-150）、驴抗山羊Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，705-165-003）、驴抗山羊AlexaFluor 488（1:500，Jackson ImmunoResearch，705-545-147）、驴抗山羊AlexaFluor 647（1:500，ThermoFisher，A32849）、驴抗大鼠Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，712-165-153）、驴抗大鼠AlexaFluor 488（1:500，ThermoFisher，A48269）。
所有孵育和清洗步骤均在振荡条件下进行。染色完成后，将类原肠胚置于载玻片与盖玻片之间，并用RapiClear溶液（152001，SunJin Lab）封片。样品使用X Light V3 CREST共聚焦旋转盘显微镜（Nikon）进行成像观察。
图像采用 Fiji（ImageJ）这一开源图像分析软件进行处理。
作者声明不存在任何竞争性利益。
N.P.S. 和 S.V.P. 贡献相同。N.P.S.、S.V.P. 和 S.K. 构思并设计了实验；N.P.S.、S.V.P. 和 B.K.C. 开展了实验；N.P.S.、S.V.P.、J.V.V.、T.M.L.A. 和 M.L. 对数据进行了分析与整理；T.M.L.A. 和 J.Ø. 执行了 scRNA-seq 分析；J.V.V. 和 E.M. 对稿件提出了关键性意见；N.P.S.、S.V.P. 和 S.K. 撰写了稿件；S.K. 提供了经费支持。
本研究中使用的所有小鼠干细胞系均来自既有资源库。未使用新的实验动物，因此根据《挪威科研动物使用条例》，无需伦理审批。
RACL-aggregoid 从 72 h 至 96 h 发育过程的延时荧光影像。图像每 15 分钟采集一次。胃胚样体部分（2i 细胞）使用 BRA-GFP: SOX17-RFP 谱系，RACL 使用 BFP-ROSA26 细胞系。
a-d）整合 UMAP，分别表示对照胃胚样体（a）、RACL-（b）、NACLB-（c）和 XAL-（d）聚集体中预测的细胞。
本项目获得了奥斯陆大学、奥斯陆大学医院、挪威研究理事会卓越中心计划（资助编号 262613）、欧盟 H2020 Marie Skłodowska-Curie Actions / COFUND（资助编号 801133）以及欧洲创新委员会（EIC）（Horizon Europe）Pathfinder Challenge “Supervised Morphogenesis in Gastruloids”（资助编号 101071203）的经费支持。我们感谢 Anna Bigas 和 Susanne van den Brink（西班牙巴塞罗那 Hospital del Mar 医学研究所）提供 Rosa-BFP;Flk1-GFP mESC，感谢 Alexander Medvinsky（英国爱丁堡大学）提供 Flk1-GFP mESC，感谢 Iftach Nachman（以色列特拉维夫大学）提供 Bra-GFP;Sox17-RFP mESC。我们还要感谢奥斯陆大学生物科学系 NorMIC 成像平台的 Xian Hu（Edna），感谢其提供帮助并开放旋转盘显微镜用于胃胚样体成像。
由于需要修正原始版本中的若干错误，稿件已进行了修订： 1）修正了作者姓名和单位信息中的错误。 2）修正了拼写错误。 3）修正了图号与正文之间的一致性问题。 4）使补充图与正文内容保持一致。 5）更改了通讯作者。 6）修正了箭头、标记和图注说明。 7）更新了资助信息。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.11.09.687163
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