用于二元荧光开启探针的HaloTag配体与HaloTag蛋白工程

通过将特异性底物以共价方式连接到自标记蛋白标签上来实现蛋白质标记，已成为生命科学中的常规方法。在此，我们报告了一种双组分标记系统的设计，该系统由一种非荧光二氟化氧杂蒽染料——称为 F2X——以及一种经工程化改造、对 F2X 具有定向反应活性的 HaloTag 突变体组成。在配体首先于经典天冬氨酸残基处发生初始共价锁定后，位于蛋白表面的两个邻近赖氨酸残基可与 F2X 核心发生亲核芳香取代反应，通过三重共价融合构建出一种荧光罗丹明。我们采用了一种具有通用性的计算机模拟流程，对共价蛋白-配体复合物进行启发式构象采样，以寻找合适的突变位点，最终筛选出 7 种双赖氨酸 HaloTag 突变体用于定向体外测试。与表现最佳的突变体 HTPL161K_Q165K 的反应通过完整蛋白质谱、荧光偏振、荧光寿命和荧光各向异性进行了表征，并通过计算建模加以解释。我们在单分子显微镜中展示了该系统，其中免除标记后纯化是在靶向重组蛋白时的一项关键优势，因为这类蛋白可能无法以较大产量表达；同时，我们还在活细胞中应用了 F2X，并观察到光漂白降低。最后，我们通过磺化获得了一种细胞不可渗透的版本，该版本可专一性靶向暴露于细胞外的 HTPKK，该标签与神经调质性 G 蛋白偶联受体——代谢型谷氨酸受体 2 融合表达。

作者声明不存在利益竞争。

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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.15.724826v1?rss=1

🏷️ HaloTag工程 荧光开启探针 蛋白质标记 共价配体设计 单分子显微成像 活细胞成像