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慢病毒载体通常用于将嵌合抗原受体转基因导入T细胞，但常规检测仅定量载体拷贝数或整合位点，而不对全长整合载体进行测序。HIV-1前病毒常发生大片段缺失和由胞苷脱氨酶驱动的高频突变；治疗性慢病毒载体中是否也会出现类似变异尚不明确。我们改良了一种新型长读长捕获方法，以富集跨越载体DNA及其相邻人类序列的长片段，从而能够以单分子分辨率同时进行整合位点定位和前病毒完整性分析。在采用实验性瞬时转染慢病毒载体流程制备的研究级CAR T细胞中，40%的整合载体携带重复出现的缺失，这些缺失会删除内部启动子或嵌合抗原受体表达盒的部分片段。最主要的启动子缺失在病毒原液中即已存在。在临床用嵌合抗原受体T细胞产品中，启动子缺失的频率较低，但在回输前和回输后均可检测到。在各数据集中，我们观察到广泛存在与限制因子编辑一致的G到A替换，包括预计会在转基因开放阅读框内引入提前终止密码子的改变。我们的方法揭示了标准质量控制检测无法发现的前病毒变异，并为改进载体生产以及监测临床产品中的转基因完整性提供了框架。
M.L.S.是Clareo Biosciences, Inc.的联合创始人兼首席执行官（CEO）；然而，此处展示的工作与Clareo Biosciences无关。J.A.F.：拥有基于T细胞的癌症免疫治疗相关专利和知识产权并获得许可费；接受Tmunity Therapeutics和Danaher Corporation的资助；担任Retro Biosciences顾问；担任Cartography Bio、Shennon Biotechnologies Inc.、CellFe Biotech、OverT Bio, Inc.以及Tceleron Therapeutics, Inc.的科学顾问委员会成员。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.13.724601v1?rss=1
🏷️ 慢病毒载体 CAR-T细胞 前病毒变异 长读长测序 整合位点分析