利用邻位标记-质谱联用技术发掘冠状病毒HCoV-229E互作宿主因子

目的 通过邻位标记-质谱联用与生物信息学分析结合筛选与人冠状病毒229E（HCoV-229E）核衣壳蛋白（NP）相互作用的潜在宿主因子，并利用免疫共沉淀等技术验证，寻找HCoV-229E NP的相互作用蛋白，为揭示病毒复制增殖的分子机制，及不同人冠状病毒致病力差异奠定基础。方法 首先构建了表达HCoV-229E NP与生物素连接酶标签融合蛋白（NP-TurboID）的重组腺病毒Ad-V5-NP^HCoV-229E-TurboID（Ad-N），感染人非小细胞肺癌细胞A549，48 h后添加外源生物素，通过生物素连接酶标记NP相互作用蛋白，利用链霉亲和素交联的磁珠纯化生物素标记蛋白，而后进行无标记（label-free）蛋白质组学质谱分析，筛选出潜在的与NP互作的蛋白质，并通过免疫沉淀和免疫荧光等实验进行验证。结果 无标记蛋白质组学质谱筛选出584个潜在互作蛋白，从中选取糖原合成酶激酶3（GSK3）A和GSK3B进行免疫共沉淀和免疫荧光验证，实验结果表明，二者与NP^HCoV-229E存在相互作用。结论 邻位标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用因子的挖掘，为进一步研究冠状病毒复制、增殖及致病机制奠定了基础。