细菌新生RNA捕获及转录延伸速率检测方法的开发与应用

目的 检测和定量细胞中RNA的合成是一种广泛应用于监测细胞活力、健康和代谢率的技术。在环境刺激下，内参基因和靶基因都会发生一定程度的降解。因此，在受到环境刺激后，必须考虑对新生RNA的精确捕获和RNA转录水平的检测。本研究的目的是创建一种点击化学方法，利用其特性从环境刺激的总RNA中捕获新生RNA。方法 使用5-乙基尿苷（5-EU）对新生RNA进行标记，利用“点击化学”和磁珠筛选相结合的方法，将叠氮化物-生物素介质配体与磁球连接，随后捕获新生RNA并利用荧光分子信标（M.B.）和定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR）方法检测16S rRNA转录速率。结果 经过“点击化学”筛选捕获得到的细菌新生RNA可以被用作反转录模板进行反转录形成cDNA，结合荧光分子信标M.B.1准确反映37℃条件下rRNA的合成速率是15℃条件下的1.2倍，通过荧光定量PCR对16S rRNA基因和cspI基因进行检测，得到在25℃和16℃条件下用新生RNA而不是总RNA进行分析时，测量的相对基因表达的变化显著增强，实现RNA转录速率的精确检测。结论 本研究采用的技术方案较其他方法更适合细菌，操作步骤简单，易于实现，是适于研究人员使用的有效的RNA捕获方法。