LUBAC介导RabGEF1的线性泛素化修饰

目的 验证RabGEFl（Rab guanine nucleotide exchange factor 1）为线性泛素化修饰的新底物。方法 在pEF6/Myc-His C载体中克隆人RabGEF1基因。通过免疫共沉淀（Co-IP）实验验证RabGEFl和HOIP的相互作用。利用GST-pulldown实验探索RabGEFl与HOIP相互作用结构域。通过免疫荧光实验验证RabGEFl和HOIP的相互作用与亚细胞定位。应用体内泛素化实验检测RabGEF1的线性泛素化修饰。通过NTA-His泛素化实验进一步明确RabGEF1能够发生线性泛素化修饰。将RabGEF1的泛素化蛋白质样品进行质谱分析，根据质谱结果提示的RabGEF1泛素化位点构建赖氨酸位点突变质粒，进一步在体内泛素化实验中验证RabGEF1的线性泛素化修饰位点。结果 RabGEF1与HOIP存在相互作用，且HOIP通过ZF-NEF结构域与RabGEF1发生直接相互作用。RabGEF1与HOIP共同定位于细胞质。LUBAC介导RabGEF1发生线性泛素化修饰依赖于LUBAC酶活性，RabGEF1泛素化修饰位点为K158。结论 RabGEFl为线性泛素化修饰的新底物，且K158是其发生线性泛素化修饰的位点。