分离自苏云金芽胞杆菌的首例细菌乌头酸异构酶TbrA的酶学性质研究

[目的] 乌头酸异构酶（aconitate isomerase，AI）可介导具有多重生物学活性及应用潜力的小分子物质反式乌头酸（trans-aconitic acid，TAA）的合成。本文通过表征来自苏云金芽胞杆菌的生物体首条AI基因（tbrA）的产物――TbrA蛋白的催化性质，填补人们对于AI酶学特性的认识。[方法] 我们利用大肠杆菌Rosetta菌株和Ni²⁺柱亲和纯化获得了His₆-TbrA蛋白，并在体外通过HPLC检测了产物生成及对应酶活。[结果] TbrA蛋白的最适pH、温度与离子强度分别为8.0，37℃和25 mmol/L。TbrA在10℃时仍保留约60%的活性，展现了较好的耐低温特性。金属离子Mg²⁺、Ca²⁺与还原剂DTT可显著增强TbrA活性，而Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺则强烈抑制TbrA活性。TbrA将顺式乌头酸（cis-aconitic acid，CAA）异构为TAA的正反应K_m、V_max、k_cat、k_cat/K_m值分别为6.25 mmol/L、1.39 μmol/（L·s）、4.08 1/s、0.65 L/（mmol·s），将TAA异构为CAA的逆反应的上述数值分别为71.50 mmol/L、4.17 μmol/（L·s）、12.25 1/s、0.17 L/（mmol·s）。[结论] AI酶蛋白TbrA可以在温和的理化条件下表现出最高活性，且更倾向于合成TAA。本研究定量描述了TbrA催化特性，为其今后应用于TAA工业生物合成奠定基础。